本文關(guān)鍵詞：大豆根瘤表面細(xì)菌多樣性及其促植物生長(zhǎng)和結(jié)瘤能力的研究

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【摘要】：大豆是一種重要的農(nóng)作物,其與根瘤菌共生形成根瘤后能進(jìn)行生物固氮,增加植物的營(yíng)養(yǎng)供給,保持土壤肥力。大豆根際菌能促進(jìn)大豆植株生長(zhǎng)和結(jié)瘤,因此人們對(duì)大豆根際菌的研究越來(lái)越重視。但是,目前在大豆根際菌的研究中存在著一些缺陷,如：大部分研究將根際視為均一的整體,而忽視了根際不同區(qū)域間的差異；對(duì)于根際菌促進(jìn)植株生長(zhǎng)和結(jié)瘤的研究大多停留在表面,而缺乏對(duì)于相關(guān)機(jī)制的全面和深入的研究。針對(duì)這些缺陷,本研究選取了大豆根際中一個(gè)特殊的區(qū)域——根瘤表面作為研究對(duì)象,首先分析了該區(qū)域細(xì)菌群落的組成,進(jìn)而選擇了從該區(qū)域分離到的部分菌株進(jìn)行促生長(zhǎng)和促結(jié)瘤試驗(yàn),試圖探討這些菌株促進(jìn)生長(zhǎng)和結(jié)瘤的機(jī)制,并嘗試尋找這些菌株中與促進(jìn)植株生長(zhǎng)和結(jié)瘤有關(guān)的基因。在研究中,我們從大豆品種中黃13的根瘤表面共分離到92株細(xì)菌菌株。對(duì)這些菌株的16S rRNA基因進(jìn)行了測(cè)序比對(duì),并對(duì)他們可能具有的與促生相關(guān)的理化特性進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果顯示,在大豆根瘤表面分布的菌株分屬4個(gè)門(mén),Actinobacteria, Firmicutes, Proteobacteria和Bacteroidetes的14個(gè)屬。從門(mén)的水平來(lái)看,超過(guò)一半的菌株屬于Proteobacteria,與之前報(bào)道的大豆和很多其他植物的根際菌群組成非常相似。從屬的水平來(lái)看,有8個(gè)屬,包括Pseudochrobactrum(占全部菌株的17.39%),Alcaligenes(18.48%)和Lysinibacillus(9.78%)等是沒(méi)有在大豆的根際和根內(nèi)被發(fā)現(xiàn)和報(bào)道過(guò)的,說(shuō)明根瘤表面具有一些獨(dú)特的機(jī)制來(lái)構(gòu)建自己特有的菌群。從理化特性的角度分析,在根瘤表面菌群中具有產(chǎn)吲哚乙酸(IAA)能力的菌比例較大(71%),這一點(diǎn)與其他植物根際菌群比較相似。但其他三種理化特性的比例與其他植物根際菌群差異較大,其中產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的菌(30%)和鐵載體的菌(42%)比例較其他根際菌群高,而溶磷菌(8%)較低,這可能也與根瘤表面獨(dú)特的環(huán)境條件有關(guān)。根據(jù)對(duì)根瘤表面細(xì)菌群落組成分析的結(jié)果,我們選擇了其中的22株菌進(jìn)行了植物接種試驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)16株菌具有一定的促生長(zhǎng)或促結(jié)瘤能力,其中5株,包括CCNWSP78, CCNWSP60, CCNWSP46, CCNWSP15和CCNWSP13-4促生長(zhǎng)和結(jié)瘤能力比較強(qiáng)。這一結(jié)果表明,具有促生長(zhǎng)和促結(jié)瘤能力的菌株在整個(gè)根瘤表面菌群中所占比例是比較高的,這可能是因?yàn)樵搮^(qū)域離根瘤很近,關(guān)系較為密切。也說(shuō)明根瘤表面菌群是篩選、獲得促生菌的一個(gè)很好的來(lái)源。通過(guò)對(duì)植物試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,我們提出了促生菌對(duì)根瘤菌一大豆植株體系的影響方式可以分為三種類(lèi)型：一是影響結(jié)瘤過(guò)程,提高根瘤數(shù)量,進(jìn)而通過(guò)增加根系的營(yíng)養(yǎng)供給,間接的影響根系,提高根系的生物量；二是促進(jìn)植物根系生長(zhǎng),從而通過(guò)為根瘤提供更多的結(jié)瘤位點(diǎn),提高結(jié)瘤數(shù)量；三是影響結(jié)瘤過(guò)程,但并不提高根瘤數(shù)量,而是增大單個(gè)根瘤的體積。從根際菌本身的理化特性來(lái)看,我們發(fā)現(xiàn)根際菌產(chǎn)鐵載體的能力與其促進(jìn)根系生長(zhǎng)、增加根瘤數(shù)量及固氮量都有關(guān)系,而產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的能力僅與根瘤數(shù)量和固氮量的增加有關(guān)。在植物試驗(yàn)中,我們發(fā)現(xiàn)產(chǎn)堿桿菌屬(Alcaligenes)的兩個(gè)菌株CCNWSP13-4和CCNWSP30親緣關(guān)系非常接近,但促生長(zhǎng)和促結(jié)瘤能力卻相差甚遠(yuǎn)。我們通過(guò)抑制差減雜交技術(shù)試圖尋找這兩個(gè)菌株的差異基因。我們構(gòu)建了由200多個(gè)克隆組成的差減基因文庫(kù),并對(duì)其中部分克隆進(jìn)行了測(cè)序和同源性搜索,目前共獲得11個(gè)差異基因片段,其中3個(gè)可能與DNA的修飾及轉(zhuǎn)錄有關(guān),1個(gè)可能與糖代謝有關(guān),剩余的7個(gè)則都是未知功能的基因。我們還對(duì)分離自大豆根瘤表面的兩株細(xì)菌CCNWSP36-1和CCNWSP60采用多相分類(lèi)的方法進(jìn)行了鑒定。結(jié)果表明,這兩株菌株與已有各種均有一定的差異,是兩個(gè)新種。我們將其中CCNWSP36-1T所代表的新種命名為Sphingobacterium yanglingense,將CCNWSP60T所代表的新種命名為Microbacterium shaanxiense。據(jù)我們所知,這是國(guó)內(nèi)外首次以大豆根瘤表面細(xì)菌群落為主要對(duì)象開(kāi)展的研究。本研究取得了一些具有創(chuàng)新性的成果：首先,通過(guò)研究我們發(fā)現(xiàn),在大豆中黃13的根瘤表面分布的細(xì)菌群體中,Proteobacteria是占優(yōu)勢(shì),從這些根瘤表面細(xì)菌中,我們還鑒定了兩個(gè)新種,Sphingobacterium yanglingense和Microbacterium shaanxiense;其次,通過(guò)研究,我們考察了這些根瘤表面細(xì)菌的促植物生長(zhǎng)和結(jié)瘤的能力,篩選出幾株促生長(zhǎng)和結(jié)瘤能力較強(qiáng),具有一定應(yīng)用潛力的促生菌株,此外,通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析,我們對(duì)這些促生菌的促植物生長(zhǎng)和結(jié)瘤固氮的模式進(jìn)行了探討；最后,通過(guò)抑制差減雜交技術(shù)對(duì)促生能力有差異的兩株產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenes)的差異基因進(jìn)行了比較和分析,建立了差減基因文庫(kù),為后續(xù)研究與促植物生長(zhǎng)和促結(jié)瘤作用相關(guān)的功能基因提供了基礎(chǔ)。本研究的結(jié)果對(duì)于深入認(rèn)識(shí)根瘤表面細(xì)菌群落,分析豆科植物—根瘤菌—根際菌這一復(fù)雜的互作體系的運(yùn)行方式提供了一定的指導(dǎo)和參考,也為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和利用根瘤菌—根際菌混合菌劑以提高大豆產(chǎn)量提供了理論基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：大豆 根瘤 根際菌促生菌 互作 抑制差減雜交
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：S565.1;S182
【目錄】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-12
• 第一章 綜述12-24
• 1.1 大豆和根瘤菌12-13
• 1.2 根際菌13-14
• 1.3 根際細(xì)菌群落的組成和結(jié)構(gòu)14-17
• 1.3.1 土壤因素對(duì)根際細(xì)菌群落的影響14-15
• 1.3.2 植物因素對(duì)根際細(xì)菌群落的影響15-17
• 1.3.3 大豆根際菌群的組成17
• 1.4 根際細(xì)菌對(duì)植物的影響17-21
• 1.4.1 根際微生物對(duì)植物的有害影響17
• 1.4.2 根際微生物對(duì)植物的有利影響17-21
• 1.5 根際菌研究中存在的問(wèn)題21-22
• 1.6 本研究的思路及意義22-24
• 第二章 大豆根瘤菌及根瘤表面細(xì)菌的分離和鑒定24-43
• 2.1 材料與方法24-30
• 2.1.1 采樣24-25
• 2.1.2 菌株的分離及分類(lèi)鑒定25-28
• 2.1.3 根瘤表面細(xì)菌菌株促生理化特性的測(cè)定28-30
• 2.2 結(jié)果與分析30-40
• 2.2.1 土壤樣品的理化檢測(cè)結(jié)果30
• 2.2.2 根瘤菌菌株的分離鑒定和促生理化特性的檢測(cè)30-31
• 2.2.3 根瘤表面細(xì)菌菌株的分離鑒定和促生理化特性的檢測(cè)31-40
• 2.3 討論與結(jié)論40-43
• 第三章 根瘤表面細(xì)菌促大豆生長(zhǎng)和促結(jié)瘤能力的研究43-71
• 3.1 材料與方法43-47
• 3.1.1 植物試驗(yàn)所用的菌株43-46
• 3.1.2 植物試驗(yàn)設(shè)計(jì)46
• 3.1.3 植物試驗(yàn)46-47
• 3.1.4 數(shù)據(jù)處理47
• 3.2 結(jié)果與分析47-66
• 3.3 討論與結(jié)論66-71
• 第四章 產(chǎn)堿桿菌促進(jìn)植物生長(zhǎng)和結(jié)瘤差減基因文庫(kù)的構(gòu)建71-85
• 4.1 材料與方法72-79
• 4.1.1 試驗(yàn)所用菌株72-73
• 4.1.2 抑制差減雜交73-79
• 4.2 結(jié)果與分析79-83
• 4.2.1 基因組提取及酶切79
• 4.2.2 接頭連接效率分析79-80
• 4.2.3 抑制差減雜交的結(jié)果80-81
• 4.2.4 差減效率的分析81
• 4.2.5 插入片段的PCR分析81-82
• 4.2.6 序列測(cè)定、檢驗(yàn)和同源性分析82-83
• 4.3 討論與結(jié)論83-85
• 第五章 兩株根瘤表面細(xì)菌新種的鑒定85-106
• 5.1 材料與方法85-90
• 5.1.1 試驗(yàn)所用菌株85
• 5.1.2 形態(tài)特征和培養(yǎng)特征85-86
• 5.1.3 微生物的生理特征86
• 5.1.4 微生物細(xì)胞的化學(xué)組成86-88
• 5.1.5 遺傳物質(zhì)88-90
• 5.2 結(jié)果與分析90-105
• 5.2.1 對(duì)菌株CCNWSP36-1的鑒定結(jié)果90-97
• 5.2.2 對(duì)菌株CCNWSP60的鑒定結(jié)果97-105
• 5.3 討論與結(jié)論105-106
• 總結(jié)和展望106-109
• 參考文獻(xiàn)109-120
• 附錄120-129
• 縮略詞129-130
• 致謝130-131
• 作者簡(jiǎn)介131

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 關(guān)龍峰;于德海;;不同品種應(yīng)用大豆根瘤菌肥試驗(yàn)效果分析[J];黑龍江科技信息;2008年30期

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本文編號(hào)：749311