本文關(guān)鍵詞：香鱗毛蕨中黃酮代謝途徑關(guān)鍵酶基因的克隆與功能驗(yàn)證

  更多相關(guān)文章： 香鱗毛蕨 PAL C4H CHS CHI F3H Real-Time PCR 遺傳轉(zhuǎn)化

【摘要】：香鱗毛蕨[Dryopteris fragrans(L)Schott]是一種多年生的天然藥用植物。在我國(guó)黑龍江省五大連池地區(qū)分布最為廣泛。香鱗毛蕨的生境具有特殊性,比較傾向于生長(zhǎng)在火山噴發(fā)后的熔巖地區(qū),對(duì)一些特殊環(huán)境都有一定的適應(yīng)性,但是香鱗毛蕨自然生長(zhǎng)的種群一旦遭到破壞,恢復(fù)起來非常緩慢。迄今為止,一些研究人員主要在形態(tài)解剖學(xué)觀察、化學(xué)成分的提取分離及藥理活性等方面對(duì)香鱗毛蕨進(jìn)行研究,關(guān)于香鱗毛蕨中次生代謝途徑相關(guān)酶基因的研究進(jìn)行的較少。隨著對(duì)香鱗毛蕨的不斷開發(fā)利用,野生香鱗毛蕨面臨著瀕危的現(xiàn)狀,因此對(duì)人工種植高含量有效物質(zhì)香鱗毛蕨植株的研究迫在眉睫。本論文主要是以香鱗毛蕨組織培養(yǎng)植株為材料,根據(jù)電子克隆獲得的序列及其他已知序列的保守區(qū)設(shè)計(jì)特異引物,分別克隆了香鱗毛蕨中的CHI、F3H、PAL及C4H基因的保守片段,同時(shí)初步篩選出了香鱗毛蕨中PAL基因家族的三個(gè)成員。利用Real-Time PCR方法對(duì)Df PAL基因家族Df PAL1、Df PAL2、Df P-AL3及Df C4H四個(gè)基因在香鱗毛蕨中的不同組織及不同處理?xiàng)l件下的基因表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè),初步確定對(duì)Df PAL3和Df C4H進(jìn)行深入地研究。本文采用RACE技術(shù)克隆了Df PAL3和Df C4H的c DNA全長(zhǎng),利用生物信息學(xué)分析,對(duì)兩個(gè)序列的結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)進(jìn)行了研究,通過構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹確定香鱗毛蕨的分類系統(tǒng)位置。同時(shí)成功構(gòu)建了植物表達(dá)載體p BI121-Df C4H和p BI121-Df CHS,通過侵花法對(duì)擬南芥野生型植株進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化,通過PCR方法檢測(cè)了轉(zhuǎn)基因植株,收取T1代種子。同時(shí)對(duì)轉(zhuǎn)基因植株的第一代謝產(chǎn)物和終產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)定,來初步驗(yàn)證Df C4H和Df CHS基因在黃酮類化合物生物合成途徑中的功能,從而為提高代謝產(chǎn)物進(jìn)行基因調(diào)控提供了理論依據(jù),為進(jìn)一步研究Df C4H和Df CHS基因在香鱗毛蕨中的功能奠定了基礎(chǔ)。本研究中得到的主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:1.本論文通過對(duì)香鱗毛蕨轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,篩選出黃酮代謝途徑關(guān)鍵酶基因四個(gè),分別為Df CH-I、Df F3H、Df PAL及Df C4H,同時(shí)又對(duì)這四個(gè)基因進(jìn)行了電子克隆。2.從香鱗毛蕨中克隆了Df CHI基因保守序列,大小為452 bp,與其他已知序列的一致性為55%-57%,Gen Bank序列號(hào)為KP658975。3.從香鱗毛蕨中克隆了Df F3H基因保守序列,大小為693 bp,與其他已知序列的一致性為63%-62%,Gen Bank序列號(hào)為KP658976。4.從香鱗毛蕨中分離得到苯丙氨酸解氨酶基因家族的三個(gè)成員,分別命名為Df PAL1、Df PAL2、Df-PAL3。保守片段長(zhǎng)度均為880 bp,三者之間的序列一致性為84.30%,Gen Bank序列號(hào)分別為:KF830704,KJ634145,KJ634146。通過Blastx分析得知,Df PAL1、Df PAL2和Df PAL3與已知序列的一致性分別為97%、96%及97%。5.通過Real-Time PCR方法對(duì)Df PAL基因家族及Df C4H基因在不同組織部位及不同處理?xiàng)l件下進(jìn)行表達(dá)量的檢測(cè)。結(jié)果分析可知,Df PAL3在配子體中的表達(dá)量最高,葉柄中次之,在孢子中的表達(dá)量最低,而Df PAL1和Df PAL2在這些部位的表達(dá)量很低,而且沒有什么明顯差異。Df C4H的變化趨勢(shì)與Df P-AL3大致相同。低溫、高溫以及紫外處理后發(fā)現(xiàn),Df PAL2及Df C4H的表達(dá)量均變化較大,而Df PAL1和Df PAL3則表達(dá)量比較穩(wěn)定,且沒有明顯的差異。6.通過RT-PCR和RACE技術(shù),首次從香鱗毛蕨中克隆出Df PAL3的c DNA全長(zhǎng),大小為2370 bp,ORF長(zhǎng)度為1608 bp,編碼535個(gè)氨基酸,Gen Bank序列號(hào)為KJ634146.2,Df PAL3蛋白ID為AID16057.2。生物信息學(xué)分析表明,Df PAL3蛋白的分子量、等電點(diǎn)、分子式分別為57.1966 k Da、5.88及C2537H4081N697O767S18,屬于穩(wěn)定的疏水性蛋白;二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)為α型蛋白;蛋白功能區(qū)分析顯示,Df PAL3蛋白含有PAL的功能區(qū)域,是PAL的家族成員之一;亞細(xì)胞定位分析表明,Df PAL3蛋白定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的可能性最大;沒有發(fā)現(xiàn)信號(hào)肽,屬于非分泌性蛋白;也沒有跨膜蛋白的存在;在Df PAL3蛋白的515-528氨基酸之間存在卷曲螺旋結(jié)構(gòu);對(duì)其進(jìn)行糖基化和磷酸化位點(diǎn)分析顯示,包含N-糖基化、O-糖基化及蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)個(gè)數(shù)分別為1、62和25;多重序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn),與松葉蕨、水韭、陰地蕨、蕨的相似性分別為73%、74%、77%及93%。系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果顯示,與蕨類植物陰地蕨和松葉蕨的親緣關(guān)系最近,與裸子植物的親緣關(guān)系次之,與被子植物的親緣關(guān)系略遠(yuǎn)。7.通過RT-PCR和RACE技術(shù),首次從香鱗毛蕨中克隆出Df C4H的c DNA全長(zhǎng)為2063bp,ORF長(zhǎng)度為1527 bp,編碼508個(gè)氨基酸,Gen Bank序列號(hào)為KF830705.2。Df C4H蛋白ID為AHI17493.2。生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)其分子量、等電點(diǎn)、分子式分別為58.1908 k Da、8.92、C2649H4189N719O719S18;為不穩(wěn)定的親水性蛋白;二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)為混合型蛋白;蛋白功能區(qū)預(yù)測(cè)表明,Df C4H蛋白含有細(xì)胞色素P450功能區(qū)域,是細(xì)胞色素P450的家族成員之一;定位分析顯示,Df C4H蛋白定位在細(xì)胞膜的可能性最大;Df C4H蛋白可能含有信號(hào)肽,在N端有膜蛋白的存在;也可能存在卷曲螺旋結(jié)構(gòu);對(duì)其進(jìn)行糖基化和磷酸化位點(diǎn)分析顯示,含有N-糖基化、O-糖基化及蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)個(gè)數(shù)分別為1、36和19;進(jìn)化分析表明,與蘚類植物小立碗蘚的親緣關(guān)系最近,與裸子植物次之,與被子植物的親緣關(guān)系略遠(yuǎn)。8.本文成功構(gòu)建了植物表達(dá)載體p BI121-Df C4H,通過侵花法對(duì)擬南芥野生型植株進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化,利用PCR方法對(duì)轉(zhuǎn)基因Df C4H植株進(jìn)行檢測(cè),獲得T1代種子。對(duì)T1代植株第一代謝產(chǎn)物對(duì)香豆酸含量的HPLC檢測(cè)結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)基因植株中的含量明顯高于野生型。通過對(duì)黃酮類化合物合成途徑的終產(chǎn)物花色素苷含量進(jìn)行測(cè)定,轉(zhuǎn)基因Df C4H植株中花色素苷的含量明顯高于野生型中的含量。9.本文成功構(gòu)建了植物表達(dá)載體p BI121-Df CHS,通過侵花法對(duì)擬南芥野生型植株進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化,利用PCR方法對(duì)轉(zhuǎn)基因Df CHS植株進(jìn)行檢測(cè),獲得T1代種子。通過HPLC方法對(duì)T1代植株的第一代謝產(chǎn)物查爾酮含量進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)基因Df CHS植株中的含量明顯高于野生型。通過對(duì)黃酮類化合物合成途徑的終產(chǎn)物花色素苷含量進(jìn)行測(cè)定,轉(zhuǎn)基因Df CHS植株中花色素苷的含量明顯高于野生型中的含量。
【關(guān)鍵詞】：香鱗毛蕨 PAL C4H CHS CHI F3H Real-Time PCR 遺傳轉(zhuǎn)化
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：Q943.2;S567.239
【目錄】：

• 摘要12-14
• 英文摘要14-17
• 1 前言17-29
• 1.1 香鱗毛蕨研究概述17-19
• 1.1.1 香磷毛蕨的分布及生態(tài)環(huán)境17
• 1.1.2 形態(tài)解剖學(xué)研究17-18
• 1.1.3 化學(xué)成分及藥理作用18-19
• 1.2 黃酮類化合物的研究概況19-23
• 1.2.1 黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)及分類19-20
• 1.2.2 黃酮類化合物的生理活性20-22
• 1.2.3 黃酮類化合物的合成途徑22-23
• 1.2.4 蕨類植物黃酮類化合物的研究概況23
• 1.3 黃酮合成途徑關(guān)鍵酶的研究進(jìn)展23-27
• 1.3.1 苯丙氨酸解氨酶的研究進(jìn)展23-24
• 1.3.2 肉桂酸 4-羥化酶(C4H)的研究進(jìn)展24-25
• 1.3.3 查爾酮合成酶(CHS)的研究進(jìn)展25-26
• 1.3.4 查爾酮異構(gòu)酶(CHI)的研究進(jìn)展26-27
• 1.3.5 黃烷酮3羥化酶(F3H)的研究進(jìn)展27
• 1.4 本研究的目的、意義和技術(shù)路線27-29
• 1.4.1 研究目的和意義27-28
• 1.4.2 技術(shù)路線28-29
• 2 材料與方法29-56
• 2.1 試驗(yàn)材料及其處理29
• 2.1.1 試驗(yàn)材料29
• 2.1.2 材料的組織培養(yǎng)29
• 2.2 菌株和載體29
• 2.2.1 大腸桿菌菌株29
• 2.2.2 農(nóng)桿菌菌株29
• 2.2.3 載體29
• 2.3 主要儀器29-30
• 2.4 主要藥品及試劑30-31
• 2.4.1 限制性內(nèi)切酶30
• 2.4.2 分子量標(biāo)準(zhǔn)30
• 2.4.3 抗生素配置30
• 2.4.4 培養(yǎng)基配置30
• 2.4.5 其他常用試劑30-31
• 2.5 黃酮合成關(guān)鍵酶基因的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選31
• 2.5.1 關(guān)鍵酶基因的篩選31
• 2.5.2 關(guān)鍵酶基因的電子克隆31
• 2.6 黃酮合成關(guān)鍵酶基因片段的克隆及序列分析31-38
• 2.6.1 香鱗毛蕨總RNA的提取31-32
• 2.6.2 RNA純度及濃度檢測(cè)32
• 2.6.3 香鱗毛蕨c DNA的合成32
• 2.6.4 Df CHI基因保守片段的克隆及序列分析32-35
• 2.6.5 Df F3H基因保守片段的克隆及序列分析35-36
• 2.6.6 Df PAL基因家族的篩選及序列分析36-37
• 2.6.7 Df C4H基因保守片段的克隆及序列分析37-38
• 2.7 黃酮合成關(guān)鍵酶基因在不同條件下的表達(dá)特性分析38-40
• 2.7.1 試驗(yàn)材料的處理38
• 2.7.2 香鱗毛蕨RNA的提取38-39
• 2.7.3 香鱗毛蕨c DNA的合成39
• 2.7.4 Df PAL基因家族及Df C4H實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定39-40
• 2.8 黃酮合成關(guān)鍵酶基因c DNA全長(zhǎng)的克隆及序列分析40-48
• 2.8.1 Df PAL3基因c DNA全長(zhǎng)的獲得40-45
• 2.8.2 Df PAL3基因ORF的生物信息學(xué)分析45
• 2.8.3 Df C4H基因c DNA全長(zhǎng)的獲得45-48
• 2.8.4 Df C4H基因ORF的生物信息學(xué)分析48
• 2.9 植物表達(dá)載體構(gòu)建及農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化48-53
• 2.9.1 Df C4H開放閱讀框的獲得48
• 2.9.2 Df C4H植物表達(dá)載體的構(gòu)建48-50
• 2.9.3 Df CHS開放閱讀框的獲得50-51
• 2.9.4 Df CHS植物表達(dá)載體的構(gòu)建51-52
• 2.9.5 擬南芥的種植52
• 2.9.6 農(nóng)桿菌菌液的制備52-53
• 2.9.7 對(duì)擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化53
• 2.10 轉(zhuǎn)基因擬南芥的檢測(cè)及功能分析53-56
• 2.10.1 轉(zhuǎn)基因擬南芥的篩選53-54
• 2.10.2 轉(zhuǎn)基因擬南芥的PCR鑒定54
• 2.10.3 轉(zhuǎn)基因擬南芥第一代謝產(chǎn)物的測(cè)定54-55
• 2.10.4 轉(zhuǎn)基因擬南芥生理指標(biāo)的測(cè)定55-56
• 3 結(jié)果與分析56-105
• 3.1 基因片段的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選56-60
• 3.1.1 關(guān)鍵酶基因的篩選56-57
• 3.1.2 關(guān)鍵酶基因的電子克隆57-60
• 3.2 黃酮合成關(guān)鍵酶基因片段的克隆及序列分析60-69
• 3.2.1 Df CHI基因片段的克隆及序列分析60-62
• 3.2.2 Df F3H基因片段的克隆及序列分析62-64
• 3.2.3 Df PAL基因家族的篩選及序列分析64-68
• 3.2.4 Df C4H基因保守片段的克隆與序列分析68-69
• 3.3 黃酮合成關(guān)鍵酶基因在不同條件下的表達(dá)特性分析69-72
• 3.3.1 Df PAL基因家族及Df C4H的組織特異性表達(dá)69-71
• 3.3.2 Df PAL基因家族及Df C4H在低溫條件下的表達(dá)分析71
• 3.3.3 Df PAL基因家族及Df C4H在高溫條件下的表達(dá)分析71
• 3.3.4 Df PAL基因家族及Df C4H在紫外條件下的表達(dá)分析71-72
• 3.4 DFPAL3基因c DNA全長(zhǎng)的獲得72-74
• 3.4.1 Df PAL3基因片段的克隆72-73
• 3.4.2 通過 3′RACE獲得Df PAL3基因的 3′端序列73
• 3.4.3 通過 5′RACE獲得Df PAL3基因的 5′端序列73
• 3.4.4 Df PAL3基因c DNA全長(zhǎng)的克隆73-74
• 3.5 DFPAL3基因的生物信息學(xué)分析74-81
• 3.5.1 Df PAL3基因的c DNA序列及特征74-75
• 3.5.2 Df PAL3基因ORF序列Blastx分析75
• 3.5.3 Df PAL3蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)及分析75-76
• 3.5.4 Df PAL3蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)及分析76-77
• 3.5.5 Df PAL3蛋白功能區(qū)的預(yù)測(cè)及定位分析77-78
• 3.5.6 Df PAL3蛋白的信號(hào)肽預(yù)測(cè)78-79
• 3.5.7 Df PAL3基因編碼蛋白質(zhì)的蛋白跨膜區(qū)分析79
• 3.5.8 Df PAL3基因編碼蛋白質(zhì)的卷曲螺旋預(yù)測(cè)79
• 3.5.9 Df PAL3基因編碼蛋白質(zhì)的糖基化位點(diǎn)分析79-80
• 3.5.10 Df PAL3基因編碼蛋白質(zhì)的磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)80
• 3.5.11 Df PAL3基因編碼蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)及分析80-81
• 3.5.12 Df PAL3基因編碼蛋白質(zhì)的多重比較及系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建81
• 3.6 DFC4H基因c DNA全長(zhǎng)的獲得81-87
• 3.6.1 Df C4H基因保守片段的克隆與序列分析81
• 3.6.2 通過 3′RACE獲得Df C4H基因的 3′端序列81-86
• 3.6.3 通過 5′RACE獲得Df C4H基因的 5′端序列86-87
• 3.6.4 Df C4H基因ORF的克隆87
• 3.7 DFC4H基因的生物信息學(xué)分析87-98
• 3.7.1 Df C4H基因的c DNA序列及特征87-89
• 3.7.2 Df C4H基因ORF序列Blastx分析89
• 3.7.3 Df C4H蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)及分析89-90
• 3.7.4 Df C4H蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)及分析90-91
• 3.7.5 Df C4H蛋白功能區(qū)的預(yù)測(cè)及定位分析91-92
• 3.7.6 Df C4H基因編碼氨基酸的信號(hào)肽預(yù)測(cè)92
• 3.7.7 Df C4H基因編碼氨基酸的蛋白跨膜區(qū)分析92
• 3.7.8 Df C4H基因編碼氨基酸的卷曲螺旋預(yù)測(cè)92-93
• 3.7.9 Df C4H基因編碼氨基酸的糖基化位點(diǎn)分析93-94
• 3.7.10 Df C4H基因編碼氨基酸的磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)94
• 3.7.11 Df C4H基因編碼蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)及分析94
• 3.7.12 Df C4H基因編碼氨基酸序列多重比較及系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建94-98
• 3.8 植物表達(dá)載體的構(gòu)建及農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化98-101
• 3.8.1 Df C4H基因開放閱讀框的克隆及表達(dá)載體的構(gòu)建98
• 3.8.2 p BI121-Df C4H植物表達(dá)載體的雙酶切鑒定98-99
• 3.8.3 p BI121-Df C4H重組質(zhì)粒導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌99
• 3.8.4 Df CHS基因開放閱讀框的克隆99-100
• 3.8.5 p BI121-Df CHS載體的構(gòu)建100
• 3.8.6 p BI121-Df CHS的雙酶切鑒定100-101
• 3.8.7 p BI121-Df CHS重組質(zhì)粒導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌101
• 3.9 轉(zhuǎn)基因擬南芥的檢測(cè)及功能分析101-105
• 3.9.1 轉(zhuǎn)基因擬南芥的篩選101-102
• 3.9.2 轉(zhuǎn)基因擬南芥的PCR鑒定102-103
• 3.9.3 轉(zhuǎn)基因擬南芥的第一代謝產(chǎn)物的測(cè)定103
• 3.9.4 轉(zhuǎn)基因擬南芥的生理指標(biāo)的測(cè)定103-105
• 4. 討論105-111
• 4.1 香鱗毛蕨黃酮合成關(guān)鍵酶基因的選擇105-106
• 4.2 黃酮合成關(guān)鍵酶基因保守序列的克隆及分析106
• 4.3 不同溫度及紫外處理對(duì)基因表達(dá)特性的影響106-108
• 4.4 基因全長(zhǎng)的獲得及生物信息學(xué)分析108-109
• 4.5 基因過表達(dá)植株的獲得109
• 4.6 過表達(dá)基因?qū)Υx產(chǎn)物的影響109-110
• 4.7 提高代謝產(chǎn)物含量的調(diào)控因子110-111
• 5 結(jié)論111-112
• 6 創(chuàng)新點(diǎn)112-113
• 致謝113-114
• 參考文獻(xiàn)114-128
• 攻讀博士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文128

【共引文獻(xiàn)】

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7 唐亞萍;天山雪蓮花青素生物合成關(guān)鍵酶基因的克隆及功能鑒定[D];新疆師范大學(xué);2012年

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本文編號(hào)：732598