本文關(guān)鍵詞：天然產(chǎn)物對(duì)登革病毒抑制作用研究

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【摘要】：登革病毒(dengue virus, DV)屬于黃病毒科黃病毒屬中的一個(gè)血清型亞群,依病毒包膜蛋白E的抗原性不同分為1、2、3、4四個(gè)血清型,其中2型傳播最廣泛,同一型中不同毒株也存在一定抗原差異。登革熱(dengue fever, DF)是由登革病毒感染引起的急性蟲媒傳染病,臨床特點(diǎn)為高熱、頭痛、肌肉、骨關(guān)節(jié)劇烈酸痛、皮疹、出血傾向、淋巴結(jié)腫大、白細(xì)胞計(jì)數(shù)減少和血小板減少等。重者可表現(xiàn)為登革出血熱(dengue haemorrhagic fever, DHF)和登革休克綜合征(dengue shock syndrome, DSS),登革病毒可直接侵犯心臟,高熱、缺氧可引起休克,病死率較高。近幾十年來,隨著旅游和經(jīng)濟(jì)的發(fā)展,DF發(fā)病率大幅度上升,據(jù)WHO估計(jì),全球約有超過2/5人口受到其威脅,每年約有億計(jì)的人感染該病毒。登革熱發(fā)病人數(shù)逐年增加,但由于登革四價(jià)減毒活疫苗誘發(fā)體內(nèi)中和性抗體滴度的不平衡性、抗體依賴性感染增強(qiáng)作用(Antibody dependent enhancement,ADE)的存在病毒毒力問題、抗登革病毒小分子藥物的透膜及特異性等問題的困擾,截止目前臨床尚無預(yù)防與治療登革熱的有效措施。雖然報(bào)道多種有應(yīng)用前景的登革熱疫苗和抗病毒藥物正在研究開發(fā),但卻沒有一個(gè)被正式批準(zhǔn)在臨床應(yīng)用�？梢�,登革病毒仍是當(dāng)前嚴(yán)重影響人類健康的重要病原之一。本研究的目的在于篩選具有抗登革病毒作用的天然產(chǎn)物,并從中選擇抑制效果顯著的天然產(chǎn)物,分離其有效組分,并對(duì)其抗病毒的機(jī)制進(jìn)行初步探討,研究結(jié)果將為開發(fā)有效的防治登革熱藥物奠定基礎(chǔ)。首先在細(xì)胞病變抑制試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,結(jié)合細(xì)胞病變作用(cytopathic effect,CPE)觀察試驗(yàn)、MTT染色試驗(yàn)和病毒載量測(cè)定試驗(yàn)三種評(píng)價(jià)方法,建立一種快速可靠的多種指標(biāo)聯(lián)合篩選抗登革病毒藥物方法。采用上述方法檢測(cè)了40多種藥用植物和海洋微生物,獲得了抗登革病毒(DV-2)效果較好的提取物5種,其中菘藍(lán)樣品水提物的IC50為84μg/mL, TI為55.83,將其選為進(jìn)一步研究的對(duì)象。通過進(jìn)一步分離純化菘藍(lán)地上部分的成分,獲得單體化合物,采用體內(nèi)、外兩種試驗(yàn)方法對(duì)單體化合物抗登革病毒效果進(jìn)行研究。體外試驗(yàn)包括DV-2對(duì)C6/36細(xì)胞CPE觀察試驗(yàn)、MTT染色試驗(yàn)和病毒載量測(cè)定試驗(yàn)。體外細(xì)胞試驗(yàn)過程中采用先感染病毒后給藥、先給藥后感染病毒和藥物與病毒同時(shí)作用三種方式進(jìn)行抗病毒機(jī)制的初步探討。體內(nèi)試驗(yàn)采用小鼠染毒試驗(yàn)。體外試驗(yàn)結(jié)果顯示,菘藍(lán)地上部分分離化合物GB-7和GB-8對(duì)DV-2在細(xì)胞水平均有較好的抑制作用,初步研究表明菘藍(lán)地上部分分離化合物抗登革病毒機(jī)制與其對(duì)病毒在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制增殖的抑制作用有關(guān),而與其對(duì)病毒吸附細(xì)胞的阻斷作用及對(duì)病毒的直接滅活作用相關(guān)不大。體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果顯示：菘藍(lán)地上部分分離化合物GB-7和GB-8給藥組,與未給藥的對(duì)照組相比,小鼠的存活率、生存時(shí)間均有提高,尤其是化合物GB-7組,說明菘藍(lán)單體化合物對(duì)登革病毒感染的小鼠具有保護(hù)和治療作用,能明顯延長(zhǎng)感染登革病毒小鼠的存活時(shí)間,提高生存率。從菘藍(lán)地上部分水溶部分分離得到的化合物GB-7,經(jīng)一系列化學(xué)反應(yīng)檢測(cè)呈陽性,可確定其活性成分為苯甲醚類化合物。核磁共振檢測(cè)其1H譜、13C譜,結(jié)合譜庫檢索表明,化合物GB-7為新單體,主要成分為苯甲醚類。在Scifinder數(shù)據(jù)庫中搜索,明確化合物GB-7為新單體。本研究取得的主要成果：1、建立了一種快速可靠的篩選抗登革病毒藥物的模型,并對(duì)40多種天然產(chǎn)物樣品進(jìn)行篩選,獲得3種對(duì)DV-2有不同抑制作用的樣品。其中菘藍(lán)地上部分水溶部分對(duì)DV-2均有較好的抑制作用。2、菘藍(lán)地上部分分離化合物GB-7對(duì)DV-2在體內(nèi)和體外均有較好的抑制作用。3、菘藍(lán)地上部分分離化合物抗登革病毒機(jī)制與其對(duì)病毒在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制增殖的抑制作用有關(guān),而與其對(duì)病毒吸附細(xì)胞的阻斷作用及對(duì)病毒的直接滅活作用相關(guān)不大。4、初步確定.菘藍(lán)地上部分提取物中DV-2的有效組分為苯甲醚類物質(zhì)。5、菘藍(lán)地上部分分離化合物GB-7為新單體,主要成分為苯甲醚類。
【關(guān)鍵詞】：天然產(chǎn)物 登革病毒 抑制作用 篩選 有效組分
【學(xué)位授予單位】：福建農(nóng)林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R373
【目錄】：

• 中文摘要7-9
• 英文摘要9-12
• 1 文獻(xiàn)綜述12-26
• 1.1 登革熱簡(jiǎn)介12-14
• 1.2 登革病毒14-17
• 1.3 登革疫苗研究17
• 1.4 抗登革病毒藥物研究17-19
• 1.5 植物源抗病毒藥物的研究19-22
• 1.6 菘藍(lán)化學(xué)成分及抗病毒研究22-23
• 1.7 天然產(chǎn)物抗登革病毒可能機(jī)理23-24
• 1.8 天然產(chǎn)物抗登革病毒研究存在問題24
• 1.9 本研究的目的和內(nèi)容24-26
• 2 抗登革病毒天然產(chǎn)物篩選模型的建立26-41
• 前言26
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料26-27
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法27-29
• 2.3 結(jié)果與分析29-38
• 2.4 討論38-40
• 2.5 小結(jié)40-41
• 3 抗登革病毒天然產(chǎn)物的篩選41-60
• 前言41
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料41-44
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法44-48
• 3.3 結(jié)果與分析48-58
• 3.4 討論58-59
• 3.5 小結(jié)59-60
• 4 菘藍(lán)地上部分分離化合物的純化和結(jié)構(gòu)解析60-98
• 前言60
• 4.1 材料與方法60-62
• 4.2 結(jié)果與分析62-97
• 4.3 討論97
• 4.4 小結(jié)97-98
• 5 菘藍(lán)分離成分抑制登革病毒效果評(píng)價(jià)及機(jī)制初探98-113
• 前言98
• 5.1 材料與方法98-101
• 5.2 結(jié)果與分析101-110
• 5.3 討論110-112
• 5.4 小結(jié)112-113
• 6 總結(jié)113-114
• 參考文獻(xiàn)114-122
• 附錄1 主要英文縮寫詞表122-124
• 附錄2 所用主要試劑與緩沖液的配制124-127
• 附錄3 部分化合物的~1H NMR譜和~(13)C NMR譜127-146
• 附錄4 攻博期間發(fā)表論文及其它成果146-148
• 致謝148

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