本文關(guān)鍵詞：殼聚糖酶OU01底物結(jié)合與催化機理研究

  更多相關(guān)文章： 殼聚糖酶 復(fù)合物結(jié)構(gòu) X-射線晶體學 突變 水解機理

【摘要】：殼寡糖是具有多種生物學功能的生物活性物質(zhì),在醫(yī)藥衛(wèi)生、食品、農(nóng)業(yè)等方面都具有廣泛的研究及應(yīng)用。在殼寡糖的制備方法中,以殼聚糖酶為基礎(chǔ)的酶降解法具有專一性強,酶切效率高,反應(yīng)條件溫和,環(huán)保等優(yōu)點,正受到越來越多的關(guān)注。迄今為止,已經(jīng)從細菌、植物組織里發(fā)現(xiàn)了多種殼聚糖酶,對殼聚糖酶的基本性質(zhì)、水解方式等都開展了研究。目前,已有三種殼聚糖酶單體的結(jié)構(gòu)得到解析,為殼聚糖酶的研究提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ),但殼聚糖酶對底物的降解機制仍然不清楚。為此,本論文通過培養(yǎng)酶與底物復(fù)合物晶體,解析復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu),從分子水平上對殼聚糖酶與底物的結(jié)合機理進行深入研究。本研究選取了酶活性較高的chitosanase OU01為研究對象,主要進行了以下幾個方面的工作：1、從菌株Microbacterium sp的基因組中克隆了不含信號肽的chitosanase OU01基因。將基因與pGEX-6p-1相連,轉(zhuǎn)化到E. coli BL21(DE3)中,構(gòu)建了chitosanaseOU01的原核表達系統(tǒng)。通過IPTG誘導成功表達了重組蛋白。通過親和層析、柱上酶切和凝膠過濾層析對重組蛋白進行了分離純化,最終獲得高純度的chitosanase OU01,電泳結(jié)果顯示其分子量在30 kDa左右。2、利用TLC,質(zhì)譜,NMR技術(shù)對chitosanase OU01的動力學參數(shù)、酶解產(chǎn)物、水解動力學進行了研究�；緞恿W參數(shù)如下：Km為4.197mg/ml,最大反應(yīng)速率Vmax為0.049 μmol/min,催化常數(shù)Kcat為12,297 min-1,比活力為476.6U/mg·protein;對脫乙酰度大于90%(DDA90%)殼聚糖進行充分水解后得到的產(chǎn)物主要為殼二糖和殼三糖：水解脫乙酰度大于99%(DDA99%)殼聚糖的整體水解過程表現(xiàn)出先快后慢的非均一性動力學過程。3、參考序列比對,利用定點突變技術(shù)將兩個氨基酸(Glu25與Asp43)分別突變成Ala,獲得無催化活性的突變體,用于與殼六糖底物共混,進行復(fù)合物結(jié)晶。經(jīng)過晶體生長條件的篩選與優(yōu)化,獲得了可用于X-射線衍射數(shù)據(jù)收集的復(fù)合物晶體。在此基礎(chǔ)上,對復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)進行了解析,首次獲得了殼聚糖酶與底物的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)(PDB 1D:4OLT:4QWP).4、復(fù)合物結(jié)構(gòu)的解析,進一步從結(jié)構(gòu)角度確定了chitosanase OU01采用的是"inverting"催化機理,并首次闡明了催化關(guān)鍵氨基酸在催化反應(yīng)中的作用。5、通過復(fù)合物結(jié)構(gòu),首次揭示了chitosanase OU01結(jié)合口袋內(nèi)部與每一個糖單元的相互作用。通過定點突變,進一步驗證了chitosanase OU01結(jié)合口袋內(nèi)部對底物結(jié)合起重要作用的氨基酸。6、綜合復(fù)合物結(jié)構(gòu)、產(chǎn)物結(jié)構(gòu)和分子對接分析,確定了-2位是chitosanase OU01中的底物特異性識別位點,該位點只能結(jié)合氨基葡萄糖,屬于D-X-X((-2)-(-1)-(+1))型底物特異性水解酶,該研究對chitosanase水解底物的特異性進行了重新定義。7、通過表面電荷分析與突變體活性驗證,尋找到了結(jié)合口袋之外對長鏈殼聚糖底物的結(jié)合起重要作用的氨基酸Asp40。8、依據(jù)關(guān)鍵氨基酸殘基對不同底物活性的影響及空間結(jié)構(gòu),對參與底物結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸進行了分類,在此基礎(chǔ)上,闡明了兩類底物(寡糖底物和長鏈底物)與酶的復(fù)合物形成機理,并首次提出了長鏈底物與殼聚糖酶的“三步”結(jié)合原理。9、通過復(fù)合物與文獻報道的殼聚糖酶單體的結(jié)構(gòu)比較,明確了“非連續(xù)”型殼聚糖酶在結(jié)構(gòu)上的兩個重要特征,一是結(jié)合口袋在水解過程中按照“開放-關(guān)閉-開放”的形式進行構(gòu)象變化;二是參與底物結(jié)合的位點多為極性氨基酸,因此,酶與底物之間形成的相互作用主要是專一的氫鍵和靜電作用。本研究主要通過酶與底物的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)的解析,結(jié)合定點突變等生化技術(shù),對chitosanase OU01的催化機理、酶切位點特異性、酶與底物復(fù)合物形成機理、“非連續(xù)”型殼聚糖酶結(jié)構(gòu)特點等進行了研究,為殼聚糖酶的開發(fā)及應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：殼聚糖酶 復(fù)合物結(jié)構(gòu) X-射線晶體學 突變 水解機理
【學位授予單位】：中國海洋大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：Q55
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-16
• 第一章 文獻綜述16-36
• 1 殼寡糖概述16-19
• 1.1 殼寡糖的來源及功能16-18
• 1.2 殼寡糖的制備18-19
• 2 殼聚糖酶概述19-23
• 2.1 殼聚糖酶的來源19-20
• 2.2 殼聚糖酶的分類20-21
• 2.3 殼聚糖酶基因的獲得及體外異源表達系統(tǒng)構(gòu)建21-22
• 2.4 殼聚糖酶的性質(zhì)22
• 2.5 殼聚糖巧的生物學功能及應(yīng)用22-23
• 3 蛋白質(zhì)X-射線晶體學概述23-29
• 3.1 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的測定方法23-24
• 3.2 蛋白質(zhì)X-射線晶體學概述24-29
• 4 殼聚糖酶的三維空間結(jié)構(gòu)簡介29-30
• 5 GH46殼聚糖酶研究現(xiàn)狀30-35
• 5.1 殼聚糖酶的催化機理31-32
• 5.2 殼聚糖酶水解過程及產(chǎn)物分析32-33
• 5.3 殼聚糖酶中與催化相關(guān)的氨基酸功能研究33-35
• 6 選題背景和研究意義35-36
• 第二章 Chitosanase OU01在大腸桿菌中的重組表達及酶的分離純化36-52
• 第一節(jié) Chitosanse OU01基因克隆及表達載體的構(gòu)建36-46
• 1 材料與試劑36-37
• 1.1 菌株與質(zhì)粒36-37
• 1.2 試劑37
• 2 實驗方法37-42
• 2.1 細菌基因組提取37-38
• 2.2 引物設(shè)計38-39
• 2.3 PCR擴增及產(chǎn)物回收39-40
• 2.4 目的片段及表達載體的雙酶切處理40
• 2.5 目的片段與表達載體連接40-41
• 2.6 轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細胞41
• 2.7 表達菌株的構(gòu)建41-42
• 3 實驗結(jié)果42-45
• 3.1 Chitosanse OU01基因的克隆42-43
• 3.2 目的基因與表達載體雙酶切結(jié)果43-44
• 3.3 重組表達菌株的構(gòu)建44-45
• 4 討論45
• 5 小結(jié)45-46
• 第二節(jié) Chitosanse OU01在大腸桿菌中的表達及重組蛋白的分離純化46-52
• 1 材料試劑與主要儀器設(shè)備46
• 2 實驗方法46-48
• 2.1 重組蛋白的誘導表達46-47
• 2.2 菌體破碎47
• 2.3 親和層析及柱上酶切47
• 2.4 凝膠過濾層析47-48
• 3 實驗結(jié)果48-50
• 3.1 重組蛋白的表達48
• 3.2 親和層析及柱上酶切對chitosanase OU01的純化48
• 3.3 凝膠過濾層析純化結(jié)果48-50
• 4 討論50-51
• 5 小結(jié)51-52
• 第三章 Chitosanase OU01動力學參數(shù)測定、酶解產(chǎn)物及酶動力學分析52-62
• 1 實驗試劑與主要儀器52-53
• 2 實驗方法53-55
• 2.1 DNS標準曲線的制作53
• 2.2 蛋白質(zhì)濃度的測定53-54
• 2.3 殼聚糖酶活力的測定54
• 2.4 Chitosanase OU01動力學常數(shù)的測定54
• 2.5 Chitosanase OU01水解產(chǎn)物分析54-55
• 2.6 Chitosanase OU01水解動力學研究55
• 3 實驗結(jié)果55-59
• 3.1 Chitosanase OU01的米氏常數(shù)55-56
• 3.2 水解產(chǎn)物的質(zhì)譜分析56-57
• 3.3 水解產(chǎn)物的TLC分析結(jié)果57-58
• 3.4 不同時間點水解樣品的NMR分析58-59
• 3.5 水解曲線59
• 4 討論59-61
• 5 小結(jié)61-62
• 第四章 Chitosanase OU01-(GlcN)_6復(fù)合物晶體的培養(yǎng)與結(jié)構(gòu)解析62-78
• 1 實驗試劑與主要儀器62
• 2 實驗方法62-66
• 2.1 催化關(guān)鍵氨基酸的確定62-63
• 2.2 關(guān)鍵氨基酸的定點突變63-64
• 2.3 突變體蛋白的表達與分離純化64
• 2.4 突變體E25A與D43A活性測定64
• 2.5 酶與底物復(fù)合物晶體的生長與篩選64-65
• 2.6 晶體數(shù)據(jù)的收集65-66
• 2.7 晶體結(jié)構(gòu)解析66
• 3 實驗結(jié)果66-75
• 3.1 催化關(guān)鍵氨基酸的確定66-67
• 3.2 氨基酸定點突變67
• 3.3 突變體活性67
• 3.4 酶與底物復(fù)合物的形成67-68
• 3.5 晶體生長條件篩選68
• 3.6 復(fù)合物晶體衍射數(shù)據(jù)收集及結(jié)構(gòu)解析68-71
• 3.7 復(fù)合物晶體的整體結(jié)構(gòu)描述71-73
• 3.8 六糖底物的電子密度圖73-74
• 3.9 Chitosanase OU01空間結(jié)構(gòu)比較74-75
• 4 討論75-77
• 5 小結(jié)77-78
• 第五章 基于復(fù)合物結(jié)構(gòu)的底物結(jié)合特異性及催化機理研究78-103
• 第一節(jié) Chitosanase OU01結(jié)合口袋內(nèi)部酶與底物的相互作用分析78-87
• 1 實驗試劑與主要儀器78
• 2 實驗方法78-81
• 2.1 結(jié)合口袋內(nèi)酶與底物相互作用分析78
• 2.2 突變體的制備78-79
• 2.3 酶活性測定79
• 2.4 酶的熱穩(wěn)定性實驗79-81
• 3 實驗結(jié)果81-85
• 3.1 結(jié)合口袋內(nèi)部酶與底物形成的相互作用81-83
• 3.2 突變體活性測定83
• 3.3 各個突變體蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化研究(DSF)83-85
• 4 討論85-86
• 5 小結(jié)86-87
• 第二節(jié) Chitosanase OU01的催化機理研究87-92
• 1 實驗方法87
• 2 實驗結(jié)果87-89
• 2.1 E25A復(fù)合物結(jié)構(gòu)中催化關(guān)鍵作用的分析87-88
• 2.2 D43A復(fù)合物結(jié)構(gòu)中催化關(guān)鍵作用的分析88-89
• 3 討論89-91
• 4 小結(jié)91-92
• 第三節(jié) Chitosanase OU01酶切位點底物結(jié)合特異性分析92-103
• 1 實驗試劑92
• 2 實驗方法92-94
• 2.1 水解DDA=50%殼聚糖92
• 2.2 水解產(chǎn)物的質(zhì)譜分析92-93
• 2.3 水解產(chǎn)物的甲基化處理93
• 2.4 二級質(zhì)譜分析93
• 2.5 分子對接93-94
• 3 實驗結(jié)果94-98
• 3.1 水解DDA=50%殼聚糖94
• 3.2 水解產(chǎn)物質(zhì)譜分析94-95
• 3.3 水解產(chǎn)物的甲基化及質(zhì)譜分析95
• 3.4 水解產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)分析95-97
• 3.5 分子對接97-98
• 4 討論98-102
• 5 小結(jié)102-103
• 第六章 殼聚糖酶與底物復(fù)合物的形成機理103-119
• 1 實驗方法103-105
• 1.1 結(jié)合口袋外部底物結(jié)合位點預(yù)測103
• 1.2 預(yù)測氨基酸功能的驗證103-104
• 1.3 突變體D40A的酶熱穩(wěn)定分析104
• 1.4 小分子底物的制備及組分鑒定104
• 1.5 突變體對小分子底物的活性測定104-105
• 1.6 由底物結(jié)合引起的酶構(gòu)象變化分析105
• 2 實驗結(jié)果105-112
• 2.1 復(fù)合物結(jié)構(gòu)表面電荷分析及底物結(jié)合位點預(yù)測105-106
• 2.2 預(yù)測氨基酸突變體的相對酶活性106-107
• 2.3 突變體D40A熱穩(wěn)定性分析107
• 2.4 小分子底物的制備107-108
• 2.5 突變體對小分子底物的相對活性108-109
• 2.6 底物結(jié)合引起的酶構(gòu)象變化分析109-112
• 3 討論112-118
• 4 小結(jié)118-119
• 全文總結(jié)119-121
• 論文創(chuàng)新點121
• 論文不足及下一步研究計劃121-122
• 參考文獻122-131
• 致謝131-132
• 個人簡歷132-133
• 發(fā)表的學術(shù)論文133

【相似文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 袁建平;李潔;王利敏;;高產(chǎn)殼聚糖酶菌株選育[J];廊坊師范學院學報(自然科學版);2009年01期

2 屠潔;張榮華;;殼聚糖酶的研究進展與應(yīng)用現(xiàn)狀[J];江蘇農(nóng)業(yè)科學;2009年03期

3 陽麗;楊萍;王曼瑩;;12殼聚糖酶的研究進展[J];化學工程與裝備;2010年05期

4 朱英波;史鳳玉;蔡愛軍;甘金濤;;產(chǎn)殼聚糖酶培養(yǎng)基統(tǒng)計學篩選及響應(yīng)面優(yōu)化[J];江蘇農(nóng)業(yè)科學;2010年06期

5 張永勤;張杰;常海燕;張坤;劉征東;羅彩華;牟曉鳳;;高靈敏度測定殼聚糖酶活力的新方法及其比較研究[J];食品科學;2013年09期

6 王欽宏,蔡靜平;殼聚糖酶生產(chǎn)菌的篩選、鑒定及其產(chǎn)酶培養(yǎng)條件的研究[J];工業(yè)微生物;2000年04期

7 王艷,周培根,王平平,戚曉玉,林麗旋,羅一嵐;產(chǎn)殼聚糖酶菌株的初步篩選[J];中國微生態(tài)學雜志;2003年05期

8 陳小娥,夏文水,余曉斌;微生物殼聚糖酶研究進展[J];海洋科學;2004年03期

9 戴蕓,朱旭芬;微生物殼聚糖酶的研究概況[J];浙江大學學報(農(nóng)業(yè)與生命科學版);2004年02期

10 王俊英 ,陳遠童;一株高產(chǎn)胞外殼聚糖酶的優(yōu)良新菌株[J];微生物學通報;2004年04期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前8條

1 孫玉英;張繼泉;王淑軍;劉萬順;;殼聚糖酶高產(chǎn)菌株的篩選、鑒定及基因的克隆和表達研究[A];2008年中國微生物學會學術(shù)年會論文摘要集[C];2008年

2 馬鏑;;產(chǎn)殼聚糖酶菌株的篩選、鑒定及抑菌活性研究[A];科學發(fā)展與社會責任（A卷）——第五屆沈陽科學學術(shù)年會文集[C];2008年

3 楊俐;張濤;余蓉;;固態(tài)發(fā)酵貴州綠僵菌產(chǎn)殼聚糖酶及親和層析純化殼聚糖酶[A];第三屆全國化學工程與生物化工年會論文摘要集（上）[C];2006年

4 孫玉英;張繼泉;王淑軍;;殼聚糖酶高產(chǎn)菌株的篩選、鑒定及基因的克隆和表達研究[A];2008年中國微生物學會學術(shù)年會論文摘要集[C];2008年

5 陳小娥;方旭波;夏文水;;曲霉產(chǎn)殼聚糖酶的水解作用模式研究[A];2007年中國水產(chǎn)學會學術(shù)年會暨水產(chǎn)微生態(tài)調(diào)控技術(shù)論壇論文摘要匯編[C];2007年

6 燕莉莉;楊錫洪;解萬翠;王維民;章超樺;;殼聚糖在五香豬肉保鮮中的應(yīng)用初探[A];“科技創(chuàng)新與食品產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展”學術(shù)研討會暨2008年廣東省食品學會年會論文集[C];2008年

7 張匡;鄭連英;;發(fā)酵和超濾耦合制備不同分子量殼低聚糖[A];第三屆全國化學工程與生物化工年會論文摘要集（上）[C];2006年

8 燕莉莉;楊錫洪;解萬翠;章超樺;黃育崢;;殼聚糖-膠原蛋白復(fù)合膜的抑菌性的研究[A];“亞運食品安全與廣東食品產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新發(fā)展”學術(shù)研討會暨2009年廣東省食品學會年會論文集[C];2009年

中國重要報紙全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 陳銘;殼聚糖衍生化生產(chǎn)技術(shù)及其應(yīng)用和產(chǎn)品開發(fā)實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化[N];科技日報;2007年

中國博士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 孫玉英;殼聚糖酶的性質(zhì)及基因的克隆和表達研究[D];中國海洋大學;2007年

2 律倩倩;殼聚糖酶OU01底物結(jié)合與催化機理研究[D];中國海洋大學;2015年

3 段杉;無花果沙雷氏菌殼聚糖酶的生化性質(zhì)及產(chǎn)酶條件的研究[D];華南理工大學;2003年

4 劉靖;纖維素酶水解殼聚糖的特性及機理研究[D];江南大學;2006年

5 陳小娥;曲霉產(chǎn)殼聚糖酶酶學性質(zhì)及作用機理研究[D];江南大學;2004年

6 肖波;殼聚糖及其衍生物在抗菌與轉(zhuǎn)基因領(lǐng)域的研究[D];華中科技大學;2011年

7 李博;止血用殼聚糖的質(zhì)量和安全控制研究[D];江南大學;2012年

8 諶凱;殼聚糖三維材料的降解及其降解速率的調(diào)控[D];浙江大學;2011年

9 劉懷偉;腐皮鐮孢菌殼聚糖酶CSN1的基因克隆、表達及其對致病性影響的研究[D];山東大學;2010年

10 曾敏峰;聚合物輔助倒相法制備殼聚糖微孔膜的研究[D];浙江大學;2004年

中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 賈瑞秀;甲殼素及其衍生物對馬鈴薯采前和采后的影響[D];浙江工商大學;2015年

2 譚奕哲;殼聚糖抗菌劑的輻照輔助制備與研究[D];湘潭大學;2015年

3 高婧婷;殼聚糖—氧化鋅復(fù)合抗菌敷料的制備及其生物活性[D];武漢工程大學;2015年

4 高維;木聚糖酶水解殼聚糖的研究[D];武漢工業(yè)學院;2008年

5 李劍峰;高產(chǎn)殼聚糖酶菌株的篩選及其酶解產(chǎn)物的研究[D];寧波大學;2010年

6 隋斯光;殼聚糖酶的分離純化和性能研究[D];浙江大學;2005年

7 方文建;高品位殼聚糖介導基因載體制備的研究[D];浙江大學;2006年

8 周桂;殼聚糖的酶法降解研究[D];廣西大學;2005年

9 段妍;產(chǎn)殼聚糖酶菌株的發(fā)酵條件優(yōu)化、殼聚糖酶的分離純化與酶學性質(zhì)研究[D];中國海洋大學;2006年

10 肖玉良;固定化殼聚糖酶及產(chǎn)酶細胞制備殼低聚糖的研究[D];浙江大學;2004年

，

本文編號：581297