本文關(guān)鍵詞：極端耐NaHCO_3微藻的鑒定及ACBP抗逆機(jī)制研究

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【摘要】：在中國(guó)東北,大規(guī)模的土地開墾和過(guò)度放牧引起土壤侵蝕和流失,造成土壤表面的鹽分積累。松嫩平原土壤主要鹽分為碳酸鈉和碳酸氫鈉,俗稱“蘇打鹽堿土”。Na2CO3和NaHCO3給植物帶來(lái)的逆境叫做“碳酸鹽逆境”。嚴(yán)重鹽堿化區(qū)有許多“不毛之地”(pH約10.5),只有少數(shù)的植物零星分布,定義為極端鹽堿土壤環(huán)境。對(duì)富含碳酸鹽逆境的極端鹽堿土壤微藻的分類鑒定和分子機(jī)制的研究,目的是探索藻類的碳酸鹽逆境機(jī)制和獲取可能的極端耐鹽堿微藻作為作物改良和栽培的遺傳資源。1.極端鹽堿環(huán)境特殊微藻資源的分離鑒定解析(1)從極端鹽堿土壤環(huán)境分離的20種微藻,基于光學(xué)顯微鏡和掃描電鏡觀察其形態(tài)結(jié)構(gòu),結(jié)果發(fā)現(xiàn)20種微藻形態(tài)多樣,包括單細(xì)胞、定性群體和絲狀體等。(2)為進(jìn)一步對(duì)形態(tài)學(xué)分類進(jìn)行校正和補(bǔ)充,通過(guò)18S rRNA基因序列分類鑒定微藻。結(jié)果顯示20種微藻分為6個(gè)綱和13個(gè)屬。(3)為獲得極端耐鹽堿微藻資源,通過(guò)NaCl和NaHCO3處理來(lái)檢測(cè)微藻的長(zhǎng)勢(shì)。利用透射電鏡(TEM)觀察處理后藻類細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化。檢測(cè)NaHCO3處理下的長(zhǎng)勢(shì)、干重和葉綠素a含量。結(jié)果顯示大多數(shù)藻類都具有耐鹽性,尤其是2個(gè)屬于共球藻綱的微藻(JB6和17)。TEM結(jié)果表明逆境處理下JB6和17的細(xì)胞壁比對(duì)照小球藻穩(wěn)定性強(qiáng)。長(zhǎng)勢(shì)、干重和葉綠素a含量明顯高于對(duì)照,且在1000 mM NaHCO3也能生存。結(jié)果表明,獲得2個(gè)極端耐受NaHCO3的微藻。2.耐鹽堿小球藻全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)構(gòu)建及耐NaHCO3基因篩選(1)為構(gòu)建耐NaHCO3小球藻cDNA文庫(kù),通過(guò)cDNA Library Construction Kit合成全長(zhǎng)cDNA雙鏈,通過(guò)PCR的方式獲得pYES2線性載體。利用In-Fusion技術(shù)將載體與cDNA連接,轉(zhuǎn)化酵母菌株獲得全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)。(2)為獲得與NaHCO3脅迫相關(guān)基因,通過(guò)NaHCO3逆境篩選耐性轉(zhuǎn)基因酵母,分離耐NaHCO3小球藻基因。結(jié)果共篩選出20個(gè)與NaHCO3脅迫相關(guān)基因,長(zhǎng)度分布在500-2000 bp之間。Gene Ontology (GO)注釋結(jié)果顯示這些基因與生物過(guò)程(2)、應(yīng)激反應(yīng)(7)、代謝(2)、生物調(diào)節(jié)(2)、細(xì)胞過(guò)程(7)和定位(2)相關(guān)。7個(gè)屬于與高鹽、氧化、重金屬和有毒物等脅迫響應(yīng)相關(guān)基因。3.�；o酶A結(jié)合蛋白基因(ACBP)抗逆機(jī)制研究(1) ACBP基因從耐NaHCO3小球藻cDNA文庫(kù)篩選獲得。為了解ACBP基因(ChACBP)特性,通過(guò)生物信息學(xué)方法對(duì)基因進(jìn)行分析,結(jié)果顯示cDNA全長(zhǎng)為525bp,開放閱讀框?yàn)?64 bp,編碼87個(gè)氨基酸。與已發(fā)表的其他物種ACBP序列的相似性在50-82%之間。ChACBP重組蛋白能特異結(jié)合磷脂酰膽堿(PC)。(2)為檢測(cè)ChACBP基因與非生物脅迫應(yīng)答關(guān)系,northern雜交分析表明ChACBP基因受多種非生物脅迫如高鹽、氧化、重金屬和低溫誘導(dǎo)表達(dá)量增加。(3)為驗(yàn)證ChACBP基因的抗逆性,通過(guò)逆境處理過(guò)表達(dá)ChACBP基因的酵母和擬南芥,結(jié)果顯示ChACBP具有提高耐高鹽、氧化、重金屬和低溫脅迫能力。綜上所述,這些結(jié)果顯示ChACBP基因有提高植物耐受非生物脅迫的可能性。蛋白結(jié)合實(shí)驗(yàn)暗示ChACBP可能參與小球藻的磷脂代謝,包括可能在細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中結(jié)合并運(yùn)輸PC,并可能在保護(hù)細(xì)胞膜的穩(wěn)定性上發(fā)揮重要作用。這些研究為篩選具有特殊抗逆特征的藻類種質(zhì)資源提供理論基礎(chǔ),為探究藻類的耐鹽堿分子機(jī)理并獲得潛在的耐鹽堿基因?yàn)樽魑镉N提供遺傳資源。
【關(guān)鍵詞】：極端鹽堿土 微藻鑒定 耐NaHCO_3微藻 �；o酶A結(jié)合蛋白 Northern雜交 抗性分析 脂類互作
【學(xué)位授予單位】：東北林業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：Q949.2
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-15
• 1 緒論15-28
• 1.1 引言15-16
• 1.2 微藻的分類16-17
• 1.2.1線粒體基因組與分子分類16
• 1.2.2 葉綠體基因姐與分子分類16
• 1.2.3 核基因組與分子分類16-17
• 1.3 cDNA文庫(kù)的構(gòu)建17-18
• 1.4 憸基輔酶A結(jié)合蛋白(AGBP)18-26
• 1.4.1 植物憸基輔酶A蛋白20-23
• 1.4.2 在植物生長(zhǎng)中的擬南芥憸基輔酶A結(jié)合蛋白23-24
• 1.4.3 擬南芥acyl-GoA-bitiding蛋白質(zhì)在脅迫下反應(yīng)24-25
• 1.4.4 擬南芥憸基輔酶A結(jié)合蛋白在脂質(zhì)代謝的作用25-26
• 1.4.5 結(jié)論和觀點(diǎn)26
• 1.5 本研巧的目的和意義26-28
• 2 極端鹽巧環(huán)巧特殊巧藻資源的分離鑒定解祈28-43
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料28
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法28-30
• 2.2.1 形態(tài)學(xué)觀察28-29
• 2.2.2 DNA提取和PCR29
• 2.2.3 序列分析29
• 2.2.4 抗性分析29-30
• 2.2.5 不同濃度化HC0_3微藻長(zhǎng)勢(shì)、干重和葉綠素a測(cè)定30
• 2.3 結(jié)果與分析30-40
• 2.3.1 極端鹽堿藻的形態(tài)描述30-35
• 2.3.2 18S rRNA系統(tǒng)進(jìn)化分析35-37
• 2.3.3 極端鹽堿±壤藻類抗逆特性分析37-39
• 2.3.4 NaHCO_3脅迫下共球藻綱的2個(gè)藻生物量特性分析39-40
• 2.4 討論40-41
• 2.4.1 極端鹽堿微藻的鑒定40-41
• 2.4.2 2個(gè)極端耐NaHGO_3藻的發(fā)現(xiàn)41
• 2.5 本章小結(jié)41-43
• 3 耐鹽堿小巧巧全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)構(gòu)建及尅NaHCO_3基因篩選43-58
• 3.1實(shí)驗(yàn)材料43-44
• 3.2實(shí)驗(yàn)方法44-51
• 3.2.1小球藻全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)構(gòu)建44-49
• 3.2.2抗逆轉(zhuǎn)基因酵母篩選和耐鹽堿基因的獲得49-51
• 3.2.3序列分析51
• 3.3 結(jié)果51-56
• 3.3.1 cDNA文庫(kù)的鑒定51-53
• 3.3.2 抗逆基因篩選和分析53-56
• 3.4討論56-57
• 3.5本章小結(jié)57-58
• 4 耐鹽堿小球藻ACBP基因的抗逆機(jī)制研究58-79
• 4.1 材料和方法58-65
• 4.1.1 基因的獲得和分析58
• 4.1.2 轉(zhuǎn)基因酵母抗逆性分析58
• 4.1.3 ChACBP的表達(dá)分析58-60
• 4.1.4 ChACBP在真核細(xì)胞中的定位60-61
• 4.1.5 ChACBP過(guò)表達(dá)植株的制備61
• 4.1.6 過(guò)表達(dá)植株的非生物脅迫耐受性分析61-62
• 4.1.7 電導(dǎo)率分析62
• 4.1.8 ChACBP重姐蛋白純化和結(jié)合x鎦笛，
  
  本文編號(hào)：578940
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