本文關(guān)鍵詞：SCF對造血干細(xì)胞體外擴(kuò)增特性和體內(nèi)生理功能的影響及機(jī)制

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【摘要】：來源于臍血的造血干細(xì)胞因具有干細(xì)胞含量豐富且擴(kuò)增能力強(qiáng)、免疫原性低、采集方便和對供體無害等優(yōu)勢,在未來多種血液系統(tǒng)疾病的臨床治療中具有廣闊應(yīng)用前景。然而,單份臍血體積小,其中的造血干細(xì)胞數(shù)量較少,難以滿足成年患者的治療需要,嚴(yán)重制約了臍血造血干細(xì)胞的臨床應(yīng)用。為突破這一瓶頸問題,人們力求通過體外培養(yǎng)和擴(kuò)增的方法來增加造血干細(xì)胞的數(shù)量并盡可能維持其良好的生理功能,而體外培養(yǎng)技術(shù)的關(guān)鍵在于模擬體內(nèi)造血微環(huán)境。干細(xì)胞因子(stem cell factor, SCF)作為體內(nèi)造血微環(huán)境中起決定性作用的關(guān)鍵因子,被廣泛應(yīng)用于造血干細(xì)胞體外培養(yǎng)體系,但目前其應(yīng)用策略仍無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn),導(dǎo)致造血干細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)難于標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)�；�,且擴(kuò)增后的細(xì)胞數(shù)量及質(zhì)量參差不齊。為此,本文首先考察SCF添加劑量對臍血造血干細(xì)胞體外擴(kuò)增特性的影響,并通過分析體外培養(yǎng)過程中細(xì)胞生長與SCF消耗等動力學(xué)參數(shù)的變化,認(rèn)識SCF劑量與細(xì)胞擴(kuò)增數(shù)量的關(guān)系。在此基礎(chǔ)上,通過優(yōu)化SCF添加時(shí)序,期望建立一種簡易有效的SCF添加策略。同時(shí),以非肥胖糖尿�。匕Y聯(lián)合免疫缺陷(non-obese diabete/severe combined immunodeficiency, NOD/SCID)小鼠作為動物模型,考察SCF添加策略對擴(kuò)增造血干細(xì)胞體內(nèi)植入和多系造血重建能力的影響,評價(jià)其體內(nèi)生理功能的維持和變化。最后,采用基因芯片技術(shù)分析對應(yīng)SCF添加策略擴(kuò)增的造血干細(xì)胞中與SCF作用相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中關(guān)鍵因子的基因表達(dá)差異,進(jìn)一步從分子水平上闡釋體外培養(yǎng)過程中SCF調(diào)控造血干細(xì)胞生物學(xué)特性的機(jī)制,從而為優(yōu)化造血干細(xì)胞體外培養(yǎng)體系奠定基礎(chǔ)。本文首先在無血清培養(yǎng)體系中,通過設(shè)置0、5、50和500 ng/ml四個(gè)SCF劑量,分別從總細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)、CD34+細(xì)胞和CD34+CD38細(xì)胞含量的維持和各系細(xì)胞組成等方面考察了SCF劑量對臍血CD34+細(xì)胞體外擴(kuò)增特性的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)SCF劑量在0～50 ng/ml范圍內(nèi)時(shí),總細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)與SCF之間呈劑量依賴關(guān)系,增加SCF劑量可以提高總細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù),但超過50 ng/ml之后,再提高SCF劑量則不能繼續(xù)增加總細(xì)胞數(shù)量。同時(shí),SCF劑量的提高導(dǎo)致培養(yǎng)體系中CD34+細(xì)胞和CD34+CD38細(xì)胞含量的下降速率加快。因此,綜合考慮SCF劑量對總細(xì)胞擴(kuò)增及造血干細(xì)胞含量維持這兩方面的影響,在本文研究條件下適宜的SCF劑量為50 ng/ml。進(jìn)一步分析體外培養(yǎng)過程中細(xì)胞生長與SCF消耗等動力學(xué)參數(shù),發(fā)現(xiàn)較高劑量的SCF可以促使細(xì)胞快速啟動增殖并獲得較高的比生長速率,同時(shí)還有利于延長細(xì)胞的增殖時(shí)間。此外,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞比生長速率與SCF比消耗速率在培養(yǎng)初期(0-4 d階段)呈正相關(guān),表明培養(yǎng)初期是SCF促進(jìn)造血干細(xì)胞進(jìn)入增殖狀態(tài)的關(guān)鍵時(shí)期,在此階段只有當(dāng)SCF比消耗速率大于0.15 pg/(cell×day)時(shí),才能獲得較高的細(xì)胞比生長速率,此時(shí)對應(yīng)的SCF劑量為50 ng/ml。基于上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果,本文進(jìn)一步針對SCF添加時(shí)序設(shè)計(jì)了不同的SCF添加策略,并考察其對總細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)、CD34+細(xì)胞和CD34+CD38"細(xì)胞含量維持、各系細(xì)胞組成和擴(kuò)增后CD34+細(xì)胞的二次擴(kuò)增能力等方面的影響,發(fā)現(xiàn)僅在起始培養(yǎng)基中一次性添加SCF所獲得的細(xì)胞擴(kuò)增效果與在整個(gè)培養(yǎng)過程中定期多次添加SCF的常規(guī)培養(yǎng)策略相近,因此基于SCF消耗的細(xì)胞得率由(12.2±5.2)x103 cells/ng SCF大幅提高到(44.2±24.5)×103 cells/ng SCF,顯著降低了造血干細(xì)胞體外培養(yǎng)過程的經(jīng)濟(jì)成本,并使培養(yǎng)操作更為簡易。進(jìn)一步以NOD/SCID小鼠為動物模型,考察和評價(jià)該SCF添加策略所擴(kuò)增的CD34+細(xì)胞在小鼠體內(nèi)的植入及多系造血重建能力,發(fā)現(xiàn)該策略擴(kuò)增的CD34+細(xì)胞可以在小鼠體內(nèi)成功植入并進(jìn)行多系造血重建,但其植入水平和植入細(xì)胞的集落形成能力均有所下降,說明體外培養(yǎng)過程中適量補(bǔ)加SCF對維持?jǐn)U增CD34+細(xì)胞的體內(nèi)生理功能仍具有重要作用。為了理解和認(rèn)識體外培養(yǎng)過程中SCF添加策略對造血干細(xì)胞生物學(xué)特性的影響及其作用機(jī)制,本文針對僅在初始培養(yǎng)時(shí)一次性添加SCF和定期多次添加SCF這兩種策略,采用基因芯片技術(shù)檢測了所擴(kuò)增的CD34+細(xì)胞中由SCF介導(dǎo)的PI3K-AKT和JAK-STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中關(guān)鍵分子的基因表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)了分別有68和64個(gè)基因與新鮮CD34+細(xì)胞呈差異表達(dá),采用Ingenuity Pathway Analysis (IPA)軟件分析了這些差異表達(dá)基因與造血干細(xì)胞增殖和運(yùn)動特性調(diào)控的關(guān)系。結(jié)果表明,SCF可通過PI3K-AKT和JAK-STAT這兩條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)控造血干細(xì)胞的增殖,PI3K-AKT途徑中的BTK以及JAK-STAT途徑中的CSF1R和IL4R對造血干細(xì)胞增殖起正調(diào)控作用；而PI3K-AKT途徑中的NFKBIA以及JAK-STAT途徑中的MPL和IFNG對造血干細(xì)胞增殖起負(fù)調(diào)控作用。這些差異表達(dá)基因共同作用導(dǎo)致細(xì)胞增殖能力被激活。由于這些基因在兩種SCF添加策略所擴(kuò)增的CD3礦細(xì)胞中表達(dá)水平相近,說明兩種SCF添加策略刺激造血干細(xì)胞增殖的效果相似。此外,擴(kuò)增的CD34+細(xì)胞在JAK-STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中共有23個(gè)基因與細(xì)胞的運(yùn)動特性調(diào)控相關(guān),其中,兩組中均有14個(gè)基因起正調(diào)控作用、4個(gè)基因起負(fù)調(diào)控作用,它們在兩種SCF添加策略擴(kuò)增的CD34+細(xì)胞中的差異表達(dá)的結(jié)果均導(dǎo)致細(xì)胞的遷移、趨化和歸巢能力下降。在這23個(gè)基因中,TYK2、CXCL9、CCND1、GATA3和NOS25個(gè)基因在兩種SCF添加策略擴(kuò)增的CD34+細(xì)胞間呈差異表達(dá),其中,TYK2、 CXCL9和CCND1對細(xì)胞遷移起正調(diào)控作用,在僅初始添加SCF策略擴(kuò)增的CD34+細(xì)胞中,TYK2上調(diào)表達(dá),而CXCL9和CCND1下調(diào)表達(dá),IPA軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)這些差異表達(dá)基因共同作用的結(jié)果導(dǎo)致僅初始添加SCF策略擴(kuò)增的CD34+細(xì)胞的遷移和趨化能力低于定期添加SCF策略擴(kuò)增的CD34+細(xì)胞。本文研究了SCF劑量和添加策略對造血干細(xì)胞體外擴(kuò)增特性及體內(nèi)生理功能的影響,認(rèn)識了SCF介導(dǎo)的胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中關(guān)鍵分子與細(xì)胞增殖和運(yùn)動特性的關(guān)系,為闡釋體外培養(yǎng)體系中SCF調(diào)控造血干細(xì)胞生物學(xué)特性的機(jī)理奠定了良好基礎(chǔ),對建立規(guī)模化、標(biāo)準(zhǔn)化的造血干細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)、推動造血干細(xì)胞的臨床應(yīng)用具有重要意義。
【關(guān)鍵詞】：造血干細(xì)胞 體外擴(kuò)增 干細(xì)胞因子 添加策略 生理功能 基因表達(dá)
【學(xué)位授予單位】：華東理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：Q813
【目錄】：

• 摘要5-8
• Abstract8-14
• 第1章 文獻(xiàn)綜述14-31
• 1.1 造血干細(xì)胞的生物學(xué)特性15-16
• 1.2 臍血造血干細(xì)胞的應(yīng)用16-18
• 1.3 造血干細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展18-21
• 1.3.1 基質(zhì)細(xì)胞支持的造血干細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)18-19
• 1.3.2 多細(xì)胞因子聯(lián)合應(yīng)用的造血干細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)19-20
• 1.3.3 目前造血干細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)存在的問題20-21
• 1.4 造血干細(xì)胞體外擴(kuò)增與造血微環(huán)境的關(guān)系21-23
• 1.4.1 造血干細(xì)胞分裂模式與造血微環(huán)境的關(guān)系21
• 1.4.2 微環(huán)境的構(gòu)成以及對造血干細(xì)胞體外擴(kuò)增的影響21-23
• 1.5 SCF在調(diào)控造血干細(xì)胞擴(kuò)增中的重要作用23-29
• 1.5.1 SCF及其受體23-24
• 1.5.2 SCF及其受體介導(dǎo)的胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑24-27
• 1.5.3 SCF在造血干細(xì)胞體外培養(yǎng)中的應(yīng)用27-29
• 1.6 本文主要研究內(nèi)容及其目的和意義29-31
• 第2章 材料與方法31-38
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料31-32
• 2.1.1 臍血31
• 2.1.2 培養(yǎng)基31
• 2.1.3 細(xì)胞因子31
• 2.1.4 流式細(xì)胞儀檢測用抗體31
• 2.1.5 NOD/SCID小鼠31
• 2.1.6 基因芯片31
• 2.1.7 其他試劑及材料31-32
• 2.2 實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備32
• 2.3 實(shí)驗(yàn)方法32-38
• 2.3.1 臍血單個(gè)核細(xì)胞的分離32
• 2.3.2 CD34~+細(xì)胞的分離32-33
• 2.3.3 細(xì)胞培養(yǎng)33
• 2.3.4 細(xì)胞計(jì)數(shù)33
• 2.3.5 細(xì)胞表型分析33-34
• 2.3.6 集落形成能力檢測34
• 2.3.7 培養(yǎng)液中SCF濃度的測定34-35
• 2.3.8 CD34~+細(xì)胞的二次擴(kuò)增能力分析35
• 2.3.9 CD34~+細(xì)胞在體內(nèi)的植入和多系重建能力檢測35-36
• 2.3.10 基因芯片分析36-37
• 2.3.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析37-38
• 第3章 SCF添加劑量對臍血CD34~+細(xì)胞體外擴(kuò)增的影響38-49
• 3.1 SCF劑量對臍血CD34~+細(xì)胞體外擴(kuò)增特性的影響38-43
• 3.2 SCF劑量與細(xì)胞生長動力學(xué)之間的關(guān)系43-47
• 3.3 討論47-48
• 3.4 本章小結(jié)48-49
• 第4章 SCF添加策略對造臍血CD34~+細(xì)胞體外擴(kuò)增及生理功能的影響49-62
• 4.1 SCF添加策略對臍血CD34~+細(xì)胞體外擴(kuò)增特性的影響50-52
• 4.2 SCF添加策略對擴(kuò)增CD34~+細(xì)胞二次擴(kuò)增能力的影響52
• 4.3 SCF添加策略對細(xì)胞得率的影響52-53
• 4.4 SCF添加策略對擴(kuò)增CD34~+細(xì)胞體內(nèi)植入和多系造血重建能力的影響53-60
• 4.4.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及分組53-54
• 4.4.2 NOD/SCID小鼠存活情況54
• 4.4.3 擴(kuò)增CD34~+細(xì)胞在NOD/SCID小鼠體內(nèi)的植入水平分析54-57
• 4.4.4 擴(kuò)增CD34~+細(xì)胞在NOD/SCID小鼠體內(nèi)的多系造血重建能力分析57-59
• 4.4.5 NOD/SCID小鼠骨髓和脾臟細(xì)胞中的集落形成單位分析59-60
• 4.5 討論60-61
• 4.6 本章小結(jié)61-62
• 第5章 SCF添加策略對CD34~+細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)基因表達(dá)的影響62-87
• 5.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及數(shù)據(jù)處理方法63-66
• 5.1.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)63
• 5.1.2 芯片說明63-65
• 5.1.3 管家基因的選擇65-66
• 5.1.4 數(shù)據(jù)處理方法66
• 5.2 SCF添加策略對擴(kuò)增CD34~+細(xì)胞中PI3K-AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中關(guān)鍵分子基因表達(dá)水平的影響66-72
• 5.3 SCF添加策略對擴(kuò)增CD34~+細(xì)胞中JAK-STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中關(guān)鍵分子基因表達(dá)水平的影響72-85
• 5.4 討論85
• 5.5 本章小結(jié)85-87
• 第6章 全文總結(jié)與展望87-91
• 6.1 全文總結(jié)87-89
• 6.2 創(chuàng)新點(diǎn)89
• 6.3 建議及展望89-91
• 參考文獻(xiàn)91-104
• 致謝104-105
• 研究成果10

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5 杜錚;SCF對造血干細(xì)胞體外擴(kuò)增特性和體內(nèi)生理功能的影響及機(jī)制[D];華東理工大學(xué);2015年

6 陳悅;基于造血干細(xì)胞研究妊娠期核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑暴露抑制子代造血功能的機(jī)制[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2014年

7 楊定華;vIL-10基因修飾造血干細(xì)胞誘導(dǎo)小鼠心臟移植免疫耐受的實(shí)驗(yàn)研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2003年

8 陶思;Wnt信號通路在衰老造血干細(xì)胞中的變化研究[D];華中科技大學(xué);2009年

9 丁婉婧;維甲酸受體激動劑AM80誘導(dǎo)造血干細(xì)胞分化形成的中性粒細(xì)胞的殺菌功能及機(jī)制研究[D];浙江大學(xué);2013年

10 閆鳳英;造血調(diào)控因子HAPO、PF4對造血干細(xì)胞調(diào)節(jié)的體內(nèi)外研究[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué);2005年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 張鵬;某校大學(xué)生對造血干細(xì)胞捐獻(xiàn)的認(rèn)知與意愿的研究[D];蘇州大學(xué);2014年

2 韓林峰;造血干細(xì)胞自動磁分選儀的研制及初步應(yīng)用[D];上海師范大學(xué);2009年

3 冀曉霞;基于數(shù)學(xué)模擬研究造血干細(xì)胞異常分化途徑和設(shè)計(jì)治療方案[D];華中科技大學(xué);2009年

4 金洋;臍血造血干細(xì)胞低溫保存過程的研究[D];大連理工大學(xué);2005年

5 魏婷;基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的造血干細(xì)胞差異表達(dá)基因研究[D];北京交通大學(xué);2015年

6 徐群;造血干細(xì)胞采集、分離與凍存的研究[D];南京醫(yī)科大學(xué);2001年

7 劉默;-80℃非程序降溫凍存外周造血干細(xì)胞進(jìn)行自體移植的研究[D];中國人民解放軍醫(yī)學(xué)院;2014年

8 傅華睿;異基因造血干細(xì)胞移植植入失敗后的補(bǔ)救治療策略[D];浙江大學(xué);2009年

9 段相會;血管生成素1在G-CSF誘導(dǎo)的造血干細(xì)胞動員中的作用及其機(jī)制研究[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2013年

10 蘇約翰;骨形成蛋白對造血干細(xì)胞體外擴(kuò)增特性和生理功能的影響[D];華東理工大學(xué);2014年

本文編號：530976