本文關(guān)鍵詞：多功能黑曲霉An2溶磷特性和煙草節(jié)桿菌PAO19聚磷代謝調(diào)控研究

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【摘要】：磷肥在石灰性土壤中被固定為鈣、鎂磷酸鹽(Ca-P、Mg-P),在酸性土壤中被固定為鋁、鐵磷酸鹽(Al-P、Fe-P),植物利用率不足20%。磷肥長期過度使用造成磷礦資源日趨枯竭和面源污染。磷肥面源污染和生產(chǎn)生活各種含磷污水排放導致水體富營養(yǎng)化和藻華。溶磷菌和聚磷菌分別在活化土壤固定態(tài)磷和去除水體磷酸鹽方面具有重要應用價值。目前報道的大多數(shù)溶磷菌不能溶解Mg-P、Al-P、Fe-P和磷礦粉(RP)或?qū)ζ淙芙饽芰艿?不同難溶磷酸鹽的微生物溶解機理及差異也不清楚。同時目前報道的純培養(yǎng)典型聚磷菌非常少,對其聚磷特征和代謝調(diào)控機理的研究尚很缺乏。本課題分離篩選到1株能夠高效溶解多種難溶磷酸鹽的菌株An2和1株典型聚磷菌株P(guān)A019,研究了An2的溶磷特性、機理以及PA019的聚磷特征、代謝調(diào)控機理,以期為磷肥高效利用和水體富營養(yǎng)化防治提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。 菌株An2分離自大白菜根際土壤,經(jīng)鑒定為黑曲霉(Aspergillus niger)。在最適磷酸鹽濃度和培養(yǎng)時間,An2分別從Ca-P、Mg-P、Al-P, Fe-P和RP釋放出高達1722、2066、2356、215和179mg L-1的磷。HPLC分析表明,An2主要通過分泌草酸溶解Ca-P、Mg-P、Al-P和Fe-P,而主要通過分泌酒石酸溶解RP。An2在高效溶磷的過程中適應低濃度的多種碳、氮源,耐鹽、耐酸堿和耐受金屬離子。而且An2能夠產(chǎn)生植物生長激素IAA和抑制鐮孢菌屬(Fusarium)植物病原菌。土壤固定態(tài)磷活化效果驗證表明,An2能夠有效釋放石灰性土壤、鹽堿土壤和酸性土壤中的磷。因此,An2是一株環(huán)境適應性強的多功能高效溶磷菌株,具有開發(fā)和應用價值。 菌株P(guān)AO19分離自玉米根際土壤,經(jīng)鑒定為煙草節(jié)桿菌(Arthrobacter nicotianae)。在合成污水培養(yǎng)基中培養(yǎng)12h,PAO19細胞干重磷含量高達5.2%,聚磷量為7mg L-1磷。序列分析顯示,PAO19在PPK1基因及其蛋白方面均與阿氏節(jié)桿菌(A.arilaitensis) Re117最相似。環(huán)境因子效應研究表明,磷濃度、溫度和鹽度是影響PAO19聚磷能力的關(guān)鍵因素。基因組測序分析顯示,PA019基因組大小為3.64Mb, GC含量為59.5%,包括3451個ORF,其中的2336個在KEGG數(shù)據(jù)庫獲得注釋,分析發(fā)現(xiàn)PA019擁有PhoR-PhoB和SenX3-RegX3兩套磷限制雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)。 以高磷常溫(10mg L-1磷,30℃)有利聚磷條件為對照,采用轉(zhuǎn)錄組測序(RNA-seq)技術(shù)分別研究了低磷(2mg L-1磷,30℃)和高溫(10mgL-1磷,37℃)不利聚磷條件下PAO19的聚磷代謝基因表達調(diào)控模式。低磷時,PhoR-PhoB和SenX3-RegX3處于活化狀態(tài),其核心組分堿性磷酸酶PhoA和PhoD表達顯著上調(diào),響應低磷脅迫；同時磷轉(zhuǎn)運蛋白PstSCAB表達顯著上調(diào),利于磷轉(zhuǎn)運。高溫時,PhoR-PhoB和SenX3-RegX3處于抑制狀態(tài),PhoA和PhoD表達水平非常低,響應高磷環(huán)境；同時PstSCAB的表達顯著下調(diào),不利于磷轉(zhuǎn)運。低磷和高溫兩種條件下,胞內(nèi)的磷都處于限制狀態(tài),導致ATP和polyP缺乏,其合成酶類F型ATPase、PPK1和PPGK表達上調(diào)而其降解酶類PPX和PPK2表達下調(diào),進行正反饋代謝調(diào)節(jié)。兩種條件下,糖酵解、TCA循環(huán)和氧化磷酸化等產(chǎn)能代謝途徑中的大部分酶類表達顯著上調(diào),進行ATP產(chǎn)生正反饋調(diào)節(jié)。同時,磷酸戊糖途徑、DNA復制、轉(zhuǎn)錄和蛋白合成相關(guān)大部分酶和蛋白表達顯著上調(diào),表明有限的磷源優(yōu)先滿足菌體生長。本研究初步闡明了磷濃度和溫度對菌株P(guān)AO19聚磷代謝的調(diào)控機理。
【關(guān)鍵詞】：多功能溶磷菌 黑曲霉 溶磷機制 聚磷菌 煙草節(jié)桿菌 聚磷代謝調(diào)控
【學位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：Q935
【目錄】：

• 摘要4-5
• Abstract5-10
• 第1章 引言10-30
• 1.1 磷肥使用中的問題10-11
• 1.2 水體富營養(yǎng)化及其防治中的問題11-13
• 1.3 溶磷菌的研究進展13-18
• 1.4 聚磷菌的研究進展18-27
• 1.5 本課題的研究目的及意義27-29
• 1.6 技術(shù)路線29-30
• 第2章 材料與方法30-54
• 2.1 溶解多種難溶磷酸鹽真菌的分離、篩選和鑒定30-32
• 2.2 磷酸鹽的測定——鉬銻抗法32
• 2.3 核酸電泳方法32-33
• 2.4 菌株An2溶解不同難溶磷酸鹽的動力學測定33
• 2.5 菌株An2溶解不同難溶磷酸鹽的能力和效率測定33
• 2.6 菌株An2溶解不同難溶磷酸鹽的機理研究33-34
• 2.7 菌株An2溶磷的環(huán)境適應性研究34
• 2.8 菌株An2產(chǎn)吲哚乙酸(IAA)的測定34-35
• 2.9 菌株An2抑制病原菌的測試35
• 2.10 菌株An2對不同類型土壤固定態(tài)磷的活化35-36
• 2.11 聚磷菌的分離、篩選和鑒定36-39
• 2.12 菌株P(guān)AO19的攝磷動力學測定39
• 2.13 菌株P(guān)AO19的細胞磷含量測定39-40
• 2.14 菌株P(guān)AO19的聚磷顆粒觀察40
• 2.15 菌株P(guān)AO19基因組DNA的提取40-41
• 2.16 菌株P(guān)AO19ppk1基因的PCR擴增及分析41-42
• 2.17 菌株P(guān)A019胞內(nèi)polyP的定量42
• 2.18 不同環(huán)境因子對菌株P(guān)AO19聚磷能力的影響42-43
• 2.19 菌株P(guān)AO19的基因組測序及分析43-45
• 2.20 菌株P(guān)AO19總RNA的提取45-46
• 2.21 菌株P(guān)AO19的轉(zhuǎn)錄組測序及分析46-48
• 2.22 菌株P(guān)AO19轉(zhuǎn)錄組學結(jié)果的qPCR驗證48-54
• 第3章 多功能黑曲霉An2的溶磷特性54-74
• 3.1 溶解多種難溶磷酸鹽真菌的分離、篩選和鑒定54-58
• 3.2 菌株An2溶解不同難溶磷酸鹽的動力學58-60
• 3.3 菌株An2溶解不同難溶磷酸鹽的能力及效率60-62
• 3.4 菌株An2溶解不同難溶磷酸鹽的機理及差異62-65
• 3.5 菌株An2溶磷的碳、氮源適應性65-67
• 3.6 菌株An2溶磷的耐鹽性67-68
• 3.7 菌株An2產(chǎn)IAA以及競爭抑制病原真菌68-69
• 3.8 菌株An2活化不同類型土壤中固定態(tài)磷的效果驗證69-72
• 3.9 菌株An2溶磷特性總結(jié)72-74
• 第4章 煙草節(jié)桿菌PAO19的聚磷代謝調(diào)控74-116
• 4.1 聚磷菌的分離、篩選和鑒定74-78
• 4.2 菌株P(guān)AO19的攝磷動力學78-79
• 4.3 菌株P(guān)AO19的細胞磷含量和聚磷顆粒79-80
• 4.4 菌株P(guān)AO19ppk1基因的擴增及分析80-82
• 4.5 菌株P(guān)AO19胞內(nèi)polyP的定量82-83
• 4.6 不同環(huán)境因子對菌株P(guān)AO19聚磷能力的影響83-90
• 4.7 菌株P(guān)AO19的基因組測序及分析90-98
• 4.8 菌株P(guān)AO19聚磷代謝調(diào)控的轉(zhuǎn)錄組學分析98-116
• 第5章 討論與展望116-120
• 5.1 討論116-119
• 5.2 展望119-120
• 參考文獻120-136
• 附錄136-168
• 致謝168-170
• 個人簡介170-171

【共引文獻】

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本文編號：525557