本文關(guān)鍵詞：金華豬和大約克豬泌乳期乳腺組織的microRNA和轉(zhuǎn)錄組測序分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：母乳的產(chǎn)量和質(zhì)量影響哺乳仔豬的生長速度、健康和成活率,也影響仔豬斷奶體重或適宜斷奶日齡,從而影響其后期的生長肥育性能。而泌乳性能主要取決于泌乳期乳腺組織的生長發(fā)育,例如乳腺上皮細(xì)胞的數(shù)量和活力等。為了獲得較好的哺乳仔豬生長性能,弄清母豬乳房的生物特性是非常重要的。乳腺的發(fā)育歷經(jīng)胚胎期、青春期、妊娠期、泌乳期、以及退化期等一系列時期,同時也是雌性哺乳動物出生之后唯一能夠多次生長發(fā)育的器官。乳腺的重量、DNA含量和泌乳量的高峰期大約出現(xiàn)在母豬泌乳期的21天。研究表明許多因子和激素參與了乳腺的發(fā)育和泌乳的過程。MicroRNA(miRNA)在動物生長發(fā)育、細(xì)胞分化、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡等生命活動中具有廣泛的調(diào)節(jié)作用。有研究表明,miRNA參與調(diào)節(jié)乳腺的發(fā)育及泌乳相關(guān)基因的表達。盡管關(guān)于哺乳動物乳腺發(fā)育和泌乳機制的研究開展較早,但相對于人類、小鼠、牛、羊等生物而言,豬的乳腺研究比較缺乏。本研究選擇泌乳期21天金華豬和大約克豬各3頭作為實驗材料,采取乳腺組織,提取總RNA。首先利用Illumina/Solexa高通量測序技術(shù)對金華豬和大約克豬乳腺組織進行miRNA和轉(zhuǎn)錄組測序,以獲得兩豬種乳腺組織miRNA和基因表達信息,篩選差異表達的miRNA和基因,采用生物信息學(xué)方法進一步對差異表達的miRNA和基因進行靶基因預(yù)測、基因功能注釋和KEGG通路分析。同時,采用實時熒光定量法(RT-PCR)比較了金華豬和大約克豬乳腺組織上與乳腺發(fā)育及泌乳相關(guān)基因的表達水平。具體結(jié)果如下：(1)金華豬和大約克豬乳腺組織小RNA測序分析通過測序,金華豬和大約克豬乳腺小RNA文庫中分別得到17,044,789和16,545,454條可比對的讀數(shù)。去除掉其他類型的已知小片段RNA (rRNA,tRNA, snoRNA和snRNA)、重復(fù)片段以及mRNA的降解片段后分別獲得9,672,024和6,946,954純凈序列即可用于后續(xù)miRNA的序列分析。miRNA長度分布統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)乳腺組織miRNA序列長度主要分布在20-24 nt范圍內(nèi),符合動物niRNA的長度分布特點。物種間進化分析發(fā)現(xiàn)豬乳腺組織miRNA在物種間有高度保守性,與人類的同源性最高,其次是牛和小鼠�；蚪M定位分析發(fā)現(xiàn)本實驗中檢測到的miRNA在豬基因組染色體上的位置分布差異很大,比對上18號、2號、6號染色體的miRNA數(shù)量最多,7號、8號染色體上的miRNA較少。對文庫中的已知的miRNA進行顯著性差異分析,共有417個差異表達的miRNA (P0.05),對應(yīng)著228個pre-miRNAo對差異表達的miRNA進行靶基因功能注釋和KEGG通路分析,這些基因主要富集到TGF-β、MAPK、PPAR等信號通路以及谷胱甘肽代謝、不飽和脂肪酸的生物合成等生物學(xué)過程中。這些通路對于乳腺發(fā)育以及乳汁成分合成都有重要的作用。(2)金華豬和大約克豬乳腺組織mRNA轉(zhuǎn)錄組測序分析利用RNA-seq技術(shù)對構(gòu)建的兩個品種乳腺轉(zhuǎn)錄組文庫進行測序,結(jié)果顯示金華樣品共測得約2.27Gb的數(shù)據(jù),大約克樣品中共測得約2.34Gb的數(shù)據(jù)量。將新預(yù)測的兩個樣本的基因、轉(zhuǎn)錄本和外顯子的統(tǒng)計信息與Ensembl既有的豬的參考基因組信息進行比較,分別檢測到21467和29572個轉(zhuǎn)錄本。其中最多的是在2號染色體上,其次是1號染色體,最少的是線粒體染色體。在本研究中,共獲得3032個差異表達基因(P0.05),差異表達水平比值的范圍為-20.0722到17.3565,其中上調(diào)表達的有1755個基因,下調(diào)有1247個基因。差異基因的GO和KEGG分析揭示它們涉及的通路包括氨基酸代謝通路、脂肪酸生物合成、胰島素信號通路、TGF-β信號通路、氧化磷酸化、甘油磷脂代謝、蛋白轉(zhuǎn)運等。(3) RT-PCR結(jié)果顯示,大約克乳腺組織中GHR、IGF-1R、INSR, PRLR等激素受體基因表達水平都顯著高于金華豬乳腺組織(P0.05)。乳蛋白基因CSN2在金華豬乳腺中表達水平顯著高于大約克豬(P0.01),但是LALBA基因在兩者之間差異不顯著(P0.05)。與金華豬相比,miR-138在大約克的乳腺中高表達,且差異極顯著(P0.01); miR-26a、miR-186、miR-126、miR-92a和miR-let-7g在大約克中低表達,差異極顯著(P0.01)。(4)成功分離培養(yǎng)了金華豬乳腺上皮細(xì)胞,細(xì)胞具有典型的上皮細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征。轉(zhuǎn)染miR-148a mimics和inhibitor之后,RT-PCR實驗表明了mimics能增加細(xì)胞中miR-148a的表達(P0.01),inhibitor能降低miR-148a的表達(P0.01)。
【關(guān)鍵詞】：乳腺 微小RNA 高通量測序 豬 泌乳
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S828;Q78
【目錄】：

• 縮略詞表11-13
• 摘要13-15
• Abstract15-18
• 1 文獻綜述18-37
• 1.1 乳腺的生長發(fā)育18-20
• 1.1.1 乳腺的結(jié)構(gòu)18-19
• 1.1.2 乳腺發(fā)育的過程19-20
• 1.1.3 激素調(diào)控乳腺的發(fā)育20
• 1.2 泌乳生物學(xué)20-26
• 1.2.1 乳的生物學(xué)意義20-21
• 1.2.2 乳腺的泌乳過程21-23
• 1.2.3 乳分泌的調(diào)節(jié)23
• 1.2.4 乳的組成及其功能23-26
• 1.3 母豬乳腺發(fā)育及泌乳研究26-30
• 1.3.1 豬乳腺發(fā)育26-27
• 1.3.2 母豬泌乳研究27-30
• 1.4 microRNA的研究進展30-35
• 1.4.1 miRNA的發(fā)現(xiàn)30-31
• 1.4.2 miRNA的命名31-32
• 1.4.3 miRNA的生成32
• 1.4.4 miRNA的作用機制32-33
• 1.4.5 miRNA基本特征與分布33-34
• 1.4.6 miRNA的靶基因預(yù)測和鑒定34-35
• 1.5 本研究的目的和意義35-37
• 2 利用測序技術(shù)分析金華豬和大約克豬泌乳期21天乳腺組織中microRNA的表達情況37-67
• 2.1 材料與方法37-44
• 2.1.1 實驗材料37-38
• 2.1.1.1 實驗動物37
• 2.1.1.2 主要儀器37
• 2.1.1.3 主要試劑37-38
• 2.1.2 實驗方法38-44
• 2.1.2.1 乳腺組織總RNA提取及檢測38
• 2.1.2.2 小RNA庫構(gòu)建38-42
• 2.1.2.3 Illumina測序42
• 2.1.2.4 測序數(shù)據(jù)分析42-44
• 2.2 miRNAs的生物信息學(xué)分析44-45
• 2.3 結(jié)果與分析45-60
• 2.3.1 總RNA提取及質(zhì)量檢測45-46
• 2.3.2 測序結(jié)果初步分析46-49
• 2.3.2.1 測序序列的標(biāo)準(zhǔn)化46-47
• 2.3.2.2 測序序列長度的分布分析47-49
• 2.3.3 miRNA的分類鑒定49-50
• 2.3.4 miRNA進化分析50-51
• 2.3.5 染色體定位分析51-52
• 2.3.6 miRNA的表達差異分析52-60
• 2.3.6.1 差異表達的miRNA52-53
• 2.3.6.2 差異表達miRNA靶基因預(yù)測53-54
• 2.3.6.4 KEGG分析pathway54-60
• 2.3.6.5 熒光定量驗證測序結(jié)果60
• 2.4 討論60-67
• 2.4.1 miRNA鑒定方法的選擇60-61
• 2.4.2 金華豬和大約克豬乳腺小RNA文庫構(gòu)建61-62
• 2.4.3 miRNA的進階分析62-63
• 2.4.3.1 測序miRNA的分類62
• 2.4.3.2 miRNA物種間的保守性62-63
• 2.4.3.3 miRNA染色體上的分布特征63
• 2.4.4 miRNA的表達差異分析63-67
• 2.4.4.1 差異miRNA的表達分析63-64
• 2.4.4.2 GO和KEGG分析64-65
• 2.4.4.3 miRNA與乳腺發(fā)育及泌乳功能的關(guān)系65-67
• 3 利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)(RNA-Seq)分析金華豬和大約克豬泌乳期21天乳腺組織中基因的表達情況67-88
• 3.1 材料與方法67-70
• 3.1.1 實驗材料67-68
• 3.1.1.1 實驗動物67
• 3.1.1.2 主要儀器67
• 3.1.1.3 主要試劑67-68
• 3.1.2 實驗方法68-70
• 3.1.2.1 RNA質(zhì)量檢測68
• 3.1.2.2 mRNA的分離純化和片段化68
• 3.1.2.3 cDNA合成與末端修復(fù)68
• 3.1.2.4 連接5’和3’接頭68
• 3.1.2.5 PCR擴增cDNA文庫68-69
• 3.1.2.6 Illumina Solexa測序69
• 3.1.2.7 RNA-Seq數(shù)據(jù)分析69-70
• 3.2 生物信息學(xué)分析70
• 3.3 結(jié)果與分析70-85
• 3.3.1 總RNA提取和質(zhì)量檢測70
• 3.3.2 RNA-Seq基本數(shù)據(jù)分析結(jié)果70-71
• 3.3.3 轉(zhuǎn)錄組裝配、鑒定與比較71-74
• 3.3.3.1 新預(yù)測的基因組信息與既有的參考基因組信息比較71-72
• 3.3.3.2 新預(yù)測的的轉(zhuǎn)錄本、外顯子和內(nèi)含子大小的信息比較72-74
• 3.3.4 基因表達水平分析74-85
• 3.3.4.1 RPKM頻數(shù)分析74-75
• 3.3.4.2 樣本間基因表達差異的韋氏圖75-76
• 3.3.4.3 差異基因表達分析76-77
• 3.3.4.4 差異表達基因聚類分析77-79
• 3.3.4.5 差異表達基因GO(Gene Ontology)注釋和KEGG通路分析79-85
• 3.4 討論85-88
• 3.4.1 高通量測序技術(shù)85-86
• 3.4.2 差異表達基因的分析86-88
• 4 豬乳腺組織乳腺發(fā)育及泌乳相關(guān)基因的表達研究88-102
• 4.1 材料與方法88-94
• 4.1.1 實驗材料88
• 4.1.1.1 實驗動物88
• 4.1.1.2 實驗儀器88
• 4.1.1.3 實驗試劑88
• 4.1.2 實驗方法88-94
• 4.1.2.1 乳腺組織石蠟切片準(zhǔn)備88-89
• 4.1.2.2 石蠟切片HE染色89
• 4.1.2.3 免疫組化和免疫熒光89-91
• 4.1.2.4 總RNA(含miRNA)提取步驟91
• 4.1.2.5 引物合成91-92
• 4.1.2.7 熒光定量PCR92-94
• 4.2 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析94-95
• 4.3 結(jié)果與分析95-99
• 4.3.1 金華豬泌乳期乳腺組織石蠟切片HE染色觀察95
• 4.3.2 大約克乳腺上皮細(xì)胞標(biāo)記蛋白鑒定95-96
• 4.3.3 金華豬和大約克豬乳腺組織中功能基因表達差異比較96-97
• 4.3.3.1 乳腺發(fā)育相關(guān)激素受體基因的表達水平比較96-97
• 4.3.3.2 乳蛋白基因表達水平的比較97
• 4.3.4 甲基化相關(guān)基因的差異表這97-98
• 4.3.5 GHR和ER蛋白表達比較98
• 4.3.6 乳腺相關(guān)microRNA的表達比較98-99
• 4.4 討論99-102
• 4.4.1 激素調(diào)控乳腺的發(fā)育99-101
• 4.4.2 miRNA對乳腺發(fā)育的調(diào)控101-102
• 5 金華豬乳腺上皮細(xì)胞的培養(yǎng)102-114
• 5.1 材料與方法102-108
• 5.1.1 實驗材料102-104
• 5.1.1.1 實驗動物102
• 5.1.1.2 主要儀器102
• 5.1.1.3 主要試劑102
• 5.1.1.4 主要試劑配制102-103
• 5.1.1.5 細(xì)胞培養(yǎng)器材的滅菌處理103-104
• 5.1.2 實驗方法104-108
• 5.1.2.1 金華豬乳腺細(xì)胞的培養(yǎng)104-105
• 5.1.2.2 乳腺上皮細(xì)胞HE染色觀察105-106
• 5.1.2.3 乳腺上皮細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇106
• 5.1.2.4 乳腺上皮細(xì)胞蛋白marker鑒定106-107
• 5.1.2.5 乳腺上皮細(xì)胞中miR-148a的過表達或抑制表達107-108
• 5.1.2.6 轉(zhuǎn)染后基因表達水平的檢測108
• 5.2 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析108
• 5.3 結(jié)果與分析108-112
• 5.3.1 乳腺上皮細(xì)胞的培養(yǎng)108-109
• 5.3.2 乳腺上皮細(xì)胞的復(fù)蘇109-110
• 5.3.3 乳腺上皮細(xì)胞的鑒定110
• 5.3.4 豬miR-148a mimics和inhibitor在上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)染表達110-111
• 5.3.5 miR-148a過表達或低表達RT-PCR驗證111-112
• 5.3.6 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中基因表達水平112
• 5.4 討論112-114
• 6 結(jié)論、創(chuàng)新點及研究展望114-116
• 6.1 結(jié)論114
• 6.2 創(chuàng)新點114-115
• 6.3 研究展望115-116
• 參考文獻116-123
• 附錄123-125
• 博士期間論文發(fā)表125-126
• 致謝126

【參考文獻】

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1 曲波;奶山羊乳腺發(fā)育的形態(tài)學(xué)研究[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2008年

2 李轉(zhuǎn)見;奶山羊泌乳相關(guān)miRNA鑒定及miR-2478調(diào)控機制解析[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2013年

  本文關(guān)鍵詞：金華豬和大約克豬泌乳期乳腺組織的microRNA和轉(zhuǎn)錄組測序分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：500880