發(fā)布時(shí)間：2017-06-28 07:00

  本文關(guān)鍵詞：三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum Bohlin）減數(shù)分裂相關(guān)基因的系統(tǒng)學(xué)分析、表達(dá)檢測及功能驗(yàn)證，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：有性生殖是真核生物特有的繁殖方式,減數(shù)分裂則是有性生殖的標(biāo)志性事件。真核生物在地球上分布廣泛且適應(yīng)地球復(fù)雜的生存環(huán)境,很大程度上依賴于減數(shù)分裂前期I同源染色體非姐妹染色單體間的遺傳重組。對調(diào)控此過程的相關(guān)基因的系統(tǒng)學(xué)分析可作為判斷有性生殖是否存在的重要依據(jù)。我們搜索了六大真核生物超群中5個超群的減數(shù)分裂相關(guān)基因,通過文獻(xiàn)選擇了24個相對保守的減數(shù)分裂關(guān)鍵基因。所選基因廣泛存在于已測序或已知EST序列的真核生物,并作用于減數(shù)分裂同源重組過程。本研究通過文獻(xiàn)選擇下載各真核生物超群的模式生物減數(shù)分裂關(guān)鍵基因的蛋白質(zhì)序列,利用貝葉斯建樹法對這些基因所編碼的蛋白質(zhì)做了系統(tǒng)學(xué)分析,構(gòu)建了系統(tǒng)演化拓?fù)錁�。三角褐指藻是一種廣泛分布于水體中的單細(xì)胞微藻,基因組測序工作已經(jīng)完成。由于其含有豐富的多不飽和脂肪酸(PUFAs:polyunsaturated fatty acids)和三酰基甘油(TAGs:triacylglycerols),并且具有其他特殊的生物學(xué)特性,成為近年來研究的熱點(diǎn)。然而三角褐指藻是否進(jìn)行有性生殖依然不為人知,這是良種培育和種質(zhì)保持不能不面對的問題。我們通過同源搜索和系統(tǒng)學(xué)分析在三角褐指藻基因組檢測出24個減數(shù)分裂關(guān)鍵基因的19個(Smc1,Smc2,Sme3,Smc4,Smc5, Hop1,Rad21,Spoll,Rad51,Rad50,Mndl,Pms1,Mre11,Mlh1,Mlh3,Msh2,Msh4, Msh5 and Mer3),其中包括6個減數(shù)分裂特異基因(粗體)。這些基因編碼的產(chǎn)物蛋白質(zhì)涉及姐妹染色單體的粘連,同源染色體配對調(diào)控,聯(lián)會復(fù)合體的形成,同源染色體非姐妹染色單體的同源重組等多種功能。雖然三角褐指藻中存在減數(shù)分裂相關(guān)的同源基因,但這些基因是否表達(dá),是否具有相應(yīng)的功能,通過系統(tǒng)學(xué)分析仍然不能得到確切的答案,因此我們在轉(zhuǎn)錄組水平上對部分減數(shù)分裂關(guān)鍵基因(MND1,MSH4,MSH5,MER3,MRE11,MLH1)及兩個減數(shù)分裂特異基因的五個同源基因片段(SPO11-1,SPO11-10,DMC1-2, DMC1-9,DMC1-22)進(jìn)行檢測,發(fā)現(xiàn)三角褐指藻中這些同源基因均有表達(dá)。即使這些基因都表達(dá),但表達(dá)產(chǎn)物未必參與減數(shù)分裂過程,因此這些基因的功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)必不可少。SPO 11特異調(diào)控減數(shù)分裂過程中DNA雙鏈斷裂點(diǎn)的形成,DMC 1則只在減數(shù)分裂過程中促進(jìn)同源染色體非姐妹染色單體間的交叉互換。我們從三角褐指藻基因組中成功克隆了與這兩個基因相似性很高的四個同源基因SPO11-1, SPO11-10,DMC1-2和DMC1-9,并將這些基因轉(zhuǎn)入相應(yīng)基因的酵母缺陷型菌株,用以驗(yàn)證這些基因是否具有相應(yīng)減數(shù)分裂功能。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,SPO11-10具有補(bǔ)救酵母缺陷菌株減數(shù)分裂的功能,能夠使酵母轉(zhuǎn)化株恢復(fù)正常野生型酵母的產(chǎn)孢率,而DMC1同源基因不能使酵母dmcl缺陷型菌株恢復(fù)正常野生型酵母產(chǎn)孢率。這四個減數(shù)分裂同源基因的功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果與這些基因的生物信息學(xué)分析結(jié)果一致。在目前被公認(rèn)的無性繁殖生物體內(nèi)仍然可以檢測出與減數(shù)分裂特異基因同源的基因,這一結(jié)果表明,無性繁殖生物群體很可能是由有性繁殖的祖先“退化”而來,或者該群體具有隱性有性生殖。系統(tǒng)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)三角褐指藻具有9個減數(shù)分裂特異基因中的6個,且功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)證實(shí)SPO11-10仍然具有相應(yīng)減數(shù)分裂功能,因此,即使三角褐指藻現(xiàn)在主要通過有絲分裂進(jìn)行細(xì)胞增殖而未見減數(shù)分裂過程,但也可能具有有性生殖的能力。本論文將四個海洋微藻中減數(shù)分裂特異基因的同源基因在酵母相應(yīng)缺陷型菌株中進(jìn)行表達(dá),通過互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)成功驗(yàn)證其功能,結(jié)合生物信息學(xué)分析以及相關(guān)關(guān)鍵基因的表達(dá)檢測,為不易觀察生活史類型的海洋單細(xì)胞微藻三角褐指藻生殖方式的判斷提供了新的依據(jù),也為沒有建立完善遺傳操作體系的海洋微藻基因功能研究提供了新的思路。
【關(guān)鍵詞】：有性生殖 減數(shù)分裂基因 系統(tǒng)學(xué)分析 功能驗(yàn)證 三角褐指藻
【學(xué)位授予單位】：中國海洋大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：Q943.2
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-13
• 0 前言13-43
• 1 有性生殖的概述13-18
• 1.1 繁殖的概念和類型13-14
• 1.2 細(xì)胞增殖的方式14-16
• 1.2.1 無絲分裂14-15
• 1.2.2 有絲分裂15
• 1.2.3 減數(shù)分裂15-16
• 1.3 有性生殖的意義16-18
• 2. 判定有性生殖的方法18-29
• 2.1 性過程的形態(tài)學(xué)證據(jù)18-19
• 2.2 性過程的DNA證據(jù)19-28
• 2.2.1 染色體的形態(tài)和雜合度19-20
• 2.2.2 系統(tǒng)演化不確定性20
• 2.2.3 群體遺傳學(xué)20-21
• 2.2.4 梅塞爾效應(yīng)(Meselson effect)21-23
• 2.2.5 轉(zhuǎn)座子(Transposble elements,TEs)23-24
• 2.2.6 比較基因組學(xué)24-28
• 2.3 基因功能的驗(yàn)證28-29
• 2.3.1 計(jì)算機(jī)預(yù)測基因功能28-29
• 2.3.2 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證基因功能29
• 3 減數(shù)分裂相關(guān)的基因29-35
• 3.1 減數(shù)分裂開始,DNA的復(fù)制和同源染色體配對30
• 3.2 減數(shù)分裂的進(jìn)行,同源染色體重組30-34
• 3.3 減數(shù)分裂過程的延續(xù)34-35
• 4 三角褐指藻研究現(xiàn)狀35-41
• 4.1 硅藻的分類地位及研究現(xiàn)狀35-39
• 4.2 三角褐指藻的生物學(xué)特性及研究現(xiàn)狀39-41
• 5. 本實(shí)驗(yàn)的目的和意義41-43
• 1 三角褐指藻減數(shù)分裂相關(guān)基因的系統(tǒng)學(xué)研究43-64
• 1.1 材料與方法44-47
• 1.1.1 材料44-45
• 1.1.1.1 數(shù)據(jù)來源44
• 1.1.1.2 所用的軟件、程序44-45
• 1.1.2 方法45-47
• 1.1.2.1 本地?cái)?shù)據(jù)庫的建立及本地搜索45-46
• 1.1.2.2 多序列比對和系統(tǒng)發(fā)育分析46-47
• 1.2 結(jié)果與討論47-63
• 1.3 小結(jié)63-64
• 2 三角褐指藻(P.tricornutum Bohlin)減數(shù)分裂相關(guān)基因同源基因的表達(dá)分析64-72
• 2.1 材料方法64-69
• 2.1.1 藻種及培養(yǎng)方法64-65
• 2.1.2. 三角褐指藻(P.tricornutum)總RNA的提取65-66
• 2.1.3. DNase處理總RNA,消化基因組DNA66
• 2.1.4. cDNA合成反應(yīng)(TaKaRa M-MLV RTase cDNA Synthesis Kit)66-68
• 2.1.4.1 第一鏈cDNA合成反應(yīng)66-67
• 2.1.4.2 第二鏈cDNA合成及平末端化67
• 2.1.4.3 cDNA純化67-68
• 2.1.5 減數(shù)分裂相關(guān)基因引物設(shè)計(jì)與合成68
• 2.1.6 減數(shù)分裂相關(guān)基因的RT-PCR擴(kuò)增68-69
• 2.2 結(jié)果討論69-71
• 2.2.1. RNA提取1%瓊脂糖電泳檢測69-70
• 2.2.2. 減數(shù)分裂相關(guān)基因的是否表達(dá)檢測70-71
• 2.3 小結(jié)71-72
• 3 三角褐指藻(P.tricornutum Bohlin)SPO11及DMC1同源基因的克隆72-87
• 3.1 材料與方法73-81
• 3.1.1 三角褐指藻(P.tricornutum)基因組總DNA的提取73
• 3.1.2 引物設(shè)計(jì)及合成73-74
• 3.1.3 質(zhì)粒的制備和提取74-77
• 3.1.3.1 質(zhì)粒來源及結(jié)構(gòu)74-76
• 3.1.3.2 質(zhì)粒制備76
• 3.1.3.3 質(zhì)粒的提取(堿裂解法小量提取質(zhì)粒)76
• 3.1.3.4 溶液的配制76-77
• 3.1.4 三角褐指藻基因組目的片段的PCR擴(kuò)增77
• 3.1.5 PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠回收(回收試劑盒)77-78
• 3.1.6 pYC2 NT/C及PCR產(chǎn)物雙酶切及產(chǎn)物純化回收78
• 3.1.7 連接反應(yīng)78-79
• 3.1.8 轉(zhuǎn)化79-80
• 3.1.9 陽性克隆的篩選與菌檢80
• 3.1.10 陽性克隆的測序80-81
• 3.2 結(jié)果與討論81-86
• 3.2.1 三角褐指藻基因組DNA提取81
• 3.2.2 SPO11及DMC1同源基因全長擴(kuò)增81-82
• 3.2.3 SPO11同源基因表達(dá)載體構(gòu)建82-83
• 3.2.4 DMC1同源基因表達(dá)載體構(gòu)建83-84
• 3.2.5. 表達(dá)載體檢驗(yàn)84-86
• 3.3 小結(jié)86-87
• 4 三角褐指藻(P.tricornutum)SPO11、DMC1同源基因在酵母(S.cerevisiae)中的功能驗(yàn)證87-107
• 4.1 材料與方法87-96
• 4.1.1 切除三角褐指藻SPO11-1、DMC1-9基因內(nèi)含子88-91
• 4.1.1.1 三角褐指藻SPO11-1、DMC1-9基因切除內(nèi)含子原理88-89
• 4.1.1.2 引物設(shè)計(jì)89
• 4.1.1.3 切除內(nèi)含子89-90
• 4.1.1.4 DpnI酶切及延伸產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli90
• 4.1.1.5 挑陽性單克隆擴(kuò)大培養(yǎng)、提質(zhì)粒及產(chǎn)物檢測90-91
• 4.1.1.6 陽性克隆測序91
• 4.1.2 三角褐指藻SPO11、DMC1同源基因在酵母中的功能驗(yàn)證91-96
• 4.1.2.1 菌種、培養(yǎng)基和主要試劑91-92
• 4.1.2.2 酵母突變株的鑒定92-94
• 4.1.2.3 二倍體酵母突變株的獲得94
• 4.1.2.4 酵母二倍體突變株的流式細(xì)胞檢測94-95
• 4.1.2.5 酵母高效轉(zhuǎn)化(醋酸鋰轉(zhuǎn)化法)95
• 4.1.2.6 酵母轉(zhuǎn)化株的產(chǎn)孢實(shí)驗(yàn)95-96
• 4.2. 結(jié)果與討論96-106
• 4.2.1 三角褐指藻SPO11-1、DMC1-9基因內(nèi)含子的切除96-99
• 4.2.1.1 三角褐指藻SPO11-1、DMC1-9基因切除內(nèi)含子RCR反應(yīng)96-97
• 4.2.1.2 內(nèi)含子切除反應(yīng)產(chǎn)物的DpnI酶切97-98
• 4.2.1.3 陽性單克隆的擴(kuò)大培養(yǎng)及質(zhì)粒檢測98-99
• 4.2.2 三角褐指藻SPO11、DMC1同源基因功能驗(yàn)證99-106
• 4.2.2.1 酵母突變株的鑒定99-100
• 4.2.2.2 二倍體酵母突變株的獲得及流式細(xì)胞檢測100-101
• 4.2.2.3 酵母spo11-/-突變株的產(chǎn)孢實(shí)驗(yàn)101-104
• 4.2.2.4 酵母dmc1-/-突變株的產(chǎn)孢實(shí)驗(yàn)104-106
• 4.3 小結(jié)106-107
• 5 結(jié)論107-109
• 參考文獻(xiàn)109-122
• 附錄122-126
• 致謝126-127
• 個人簡歷127
• 發(fā)表的學(xué)術(shù)論文127

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