本文關(guān)鍵詞：用于活體細(xì)胞內(nèi)多分子追蹤的大景深納米分辨方法和實(shí)驗(yàn)研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：生命科學(xué)的快速發(fā)展要求人們從單細(xì)胞和單分子水平上實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)、原位、活體地來(lái)理解物質(zhì)之間的相互作用以及生命的過(guò)程。近年來(lái),隨著激光技術(shù)、分子探針制備技術(shù)、熒光標(biāo)記技術(shù)、以及弱信號(hào)探測(cè)技術(shù)的不斷發(fā)展,使得熒光顯微鏡成為現(xiàn)代細(xì)胞生物學(xué)研究過(guò)程中必不可少的工具。然而由于衍射現(xiàn)象的存在,傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡的分辨率被限制在橫向200 nm和軸向500 nm左右,還遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到生物學(xué)研究的需求。近年來(lái),研究人員提出了許多超分辨成像方法,突破了光學(xué)衍射極限的限制,大大提高了空間分辨率,使得成像的分辨能力達(dá)到了納米量級(jí)。而在活細(xì)胞成像過(guò)程中,空間分辨率和時(shí)間分辨率是相互制約的關(guān)系,其中單分子定位的方法就是使用固定細(xì)胞成像,以犧牲時(shí)間分辨率來(lái)獲取超高的空間分辨率。而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)多分子追蹤成像,就要求在具有高空間分辨率的同時(shí)能夠快速的探測(cè)到分子的動(dòng)態(tài)過(guò)程。單分子追蹤方法的提出就為動(dòng)態(tài)追蹤成像提供了非常便利的工具,使得生物學(xué)家研究細(xì)胞、蛋白質(zhì)、以及生物大分子之間的相互作用和生理過(guò)程的現(xiàn)象都成為現(xiàn)實(shí)。盡管超分辨成像技術(shù)取得了非常巨大的進(jìn)步,但是在活細(xì)胞成像方面仍然存在著許多技術(shù)難題亟待突破,例如如何提高系統(tǒng)的成像深度即景深來(lái)獲得完整活細(xì)胞內(nèi)的動(dòng)態(tài)功能信息。目前,可以實(shí)現(xiàn)完整細(xì)胞內(nèi)動(dòng)態(tài)成像的方法主要是基于多焦面顯微成像的改進(jìn),如利用多焦面衍射光柵實(shí)現(xiàn)不同深度的并行成像方法以及利用多個(gè)探測(cè)器同時(shí)對(duì)不同深度的樣品并行探測(cè)實(shí)現(xiàn)大景深的成像方法,這些方法在實(shí)現(xiàn)過(guò)程中由于光能利用率低、系統(tǒng)復(fù)雜、成本高等原因難以廣泛應(yīng)用。本論文就是為了解決目前超分辨方法難以實(shí)現(xiàn)完整細(xì)胞成像方面提出了新的想法,利用具有三維納米分辨能力的雙螺旋點(diǎn)擴(kuò)展函數(shù)與具有擴(kuò)展景深能力的變形光柵相結(jié)合來(lái)實(shí)現(xiàn)大景深的納米分辨成像,通過(guò)該方法成功獲得了完整細(xì)胞內(nèi)高精度的多分子追蹤。論文主要工作如下:1.設(shè)計(jì)與搭建了基于雙螺旋點(diǎn)擴(kuò)展函數(shù)的三維定位成像系統(tǒng)。雙螺旋點(diǎn)擴(kuò)展函數(shù)是利用系統(tǒng)點(diǎn)擴(kuò)展函數(shù)的改造形成具有連續(xù)旋轉(zhuǎn)的雙螺旋形式,由其所在位置和旋轉(zhuǎn)角度即可獲得相應(yīng)的三維空間位置,因此該方法是實(shí)現(xiàn)三維納米分辨成像非常有效的方式。論文對(duì)DH-PSF進(jìn)行了理論模擬,并通過(guò)優(yōu)化算法提高了原始DH-PSF的光能利用率,優(yōu)化后的DH-PSF的光能效率提高了30多倍。利用光刻技術(shù)方法制備了高效DH-PSF相位片,并搭建了基于DH-PSF的三維納米定位成像系統(tǒng),實(shí)現(xiàn)了軸向深度4μm的納米成像。通過(guò)系統(tǒng)標(biāo)定,實(shí)現(xiàn)了橫向分辨率10 nm,軸向分辨率20 nm的定位精度,驗(yàn)證了系統(tǒng)用于超分辨成像的可行性。2.設(shè)計(jì)與搭建了具有雙螺旋點(diǎn)擴(kuò)展函數(shù)(DH-PSF)與變形光柵(distorted grating)功能的大景深成像系統(tǒng)(DDCM)。完整細(xì)胞的厚度通常是在10μm左右,而單獨(dú)使用DH-PSF系統(tǒng)還無(wú)法滿足對(duì)完整細(xì)胞的三維定位成像,因此需要結(jié)合其他的擴(kuò)展景深的方式來(lái)獲取。論文提出了變形光柵的擴(kuò)展方式,它實(shí)質(zhì)上是一個(gè)離軸的菲涅爾波帶片,結(jié)合光柵分光和菲涅爾波帶片的透鏡作用,可以實(shí)現(xiàn)在不同衍射級(jí)上引入不同的透鏡效應(yīng),通過(guò)模擬分析變形光柵的成像方式,驗(yàn)證了該方法實(shí)現(xiàn)對(duì)厚樣品不同深度進(jìn)行成像的可行性。并考慮到原始的振幅型變形光柵光能有效利用率低,而改進(jìn)形成相位型二元變形光柵,通過(guò)對(duì)相位臺(tái)階的設(shè)計(jì)可以獲得三個(gè)衍射級(jí)衍射效率相等,提高了光能利用率,利用該方法可以實(shí)現(xiàn)擴(kuò)大景深的要求。為了獲得完整細(xì)胞內(nèi)生物分子的動(dòng)態(tài)成像,我們將雙螺旋點(diǎn)擴(kuò)展函數(shù)(DH-PSF)與變形光柵(distorted grating)相結(jié)合形成復(fù)合形式,使其具有DH-PSF三維納米定位的能力的同時(shí),又具有變形光柵擴(kuò)大景深的能力,并通過(guò)光刻技術(shù)獲得具有雙重功用的復(fù)合相位片,并最終搭建了一套大景深的超分辨成像方法(DDCM系統(tǒng))。通過(guò)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,該系統(tǒng)具有著很好的定位精度。利用該系統(tǒng)對(duì)熒光珠在甘油溶液中的布朗運(yùn)動(dòng)進(jìn)行了追蹤成像,根據(jù)對(duì)熒光珠在甘油溶液中的擴(kuò)散系數(shù)驗(yàn)證了系統(tǒng)的可行性,并通過(guò)該系統(tǒng)成功得到了多分子在甘油溶液中的動(dòng)態(tài)追蹤結(jié)果,為實(shí)現(xiàn)完整細(xì)胞內(nèi)分子的動(dòng)態(tài)追蹤打下基礎(chǔ)。3.開(kāi)展了活細(xì)胞內(nèi)多分子的動(dòng)態(tài)追蹤實(shí)驗(yàn)研究。以DH-PSF成像系統(tǒng)和DDCM成像系統(tǒng)為平臺(tái)開(kāi)展細(xì)胞內(nèi)分子動(dòng)態(tài)追蹤的基礎(chǔ)研究。論文選擇了巨噬細(xì)胞(RAW)和喉癌細(xì)胞(HEP-2)為對(duì)象,通過(guò)兩種細(xì)胞不同的胞吞機(jī)制,對(duì)分子跨膜及胞內(nèi)運(yùn)動(dòng)的不同過(guò)程進(jìn)行研究。利用系統(tǒng)成功獲取了細(xì)胞內(nèi)多分子的動(dòng)態(tài)追蹤,并得到了在分子在細(xì)胞內(nèi)的不同運(yùn)動(dòng)模式。本論文工作的創(chuàng)新點(diǎn)是,提出一種實(shí)現(xiàn)大景深納米分辨成像的方法,設(shè)計(jì)并研制了具有變形光柵和雙螺旋點(diǎn)擴(kuò)展函數(shù)功能的復(fù)合相位片這一核心器件,擴(kuò)大顯微鏡的成像深度,使系統(tǒng)成像景深達(dá)12μm。在此基礎(chǔ)上,搭建了納米分辨熒光動(dòng)態(tài)成像系統(tǒng),解決目前研究中無(wú)法實(shí)現(xiàn)完整細(xì)胞內(nèi)的多分子動(dòng)態(tài)成像問(wèn)題。利用該方法無(wú)需掃描、層析等方式即可獲取細(xì)胞內(nèi)任意位置的納米分辨動(dòng)態(tài)信息,為生物學(xué)家提供了非常有利的工具。
【關(guān)鍵詞】：納米分辨 多分子追蹤 大景深 雙螺旋點(diǎn)擴(kuò)展函數(shù) 變形光柵
【學(xué)位授予單位】：深圳大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：Q2-33
【目錄】：

• 摘要4-7
• Abstract7-13
• 第1章 緒論13-30
• 1.1 引言13-14
• 1.2 熒光顯微技術(shù)的基礎(chǔ)14-16
• 1.2.1 熒光的產(chǎn)生14-16
• 1.2.2 熒光顯微技術(shù)16
• 1.3 熒光顯微鏡的分辨率16-18
• 1.4 超分辨熒光顯微成像技術(shù)的進(jìn)展18-22
• 1.4.1 近場(chǎng)超分辨成像技術(shù)19
• 1.4.2 遠(yuǎn)場(chǎng)超分辨顯微技術(shù)19-22
• 1.5 完整細(xì)胞三維顯微成像技術(shù)22-25
• 1.6 活細(xì)胞內(nèi)的多分子追蹤技術(shù)25-28
• 1.6.1 單分子追蹤技術(shù)26
• 1.6.2 大景深納米分辨多分子追蹤成像技術(shù)26-28
• 1.7 本論文的主要工作28-30
• 第2章 雙螺旋點(diǎn)擴(kuò)展函數(shù)30-58
• 2.1 雙螺旋點(diǎn)擴(kuò)展函數(shù)的基礎(chǔ)理論30-35
• 2.2 雙螺旋點(diǎn)擴(kuò)展函數(shù)的應(yīng)用35
• 2.3 高效DH-PSF相位片的設(shè)計(jì)35-44
• 2.3.1 優(yōu)化設(shè)計(jì)算法36-41
• 2.3.2 設(shè)計(jì)結(jié)果分析41-42
• 2.3.3 相位片制作及實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證42-44
• 2.4 基于DH-PSF的三維定位精度的理論分析44-47
• 2.5 用于DH-PSF系統(tǒng)的熒光標(biāo)記47-49
• 2.6 高效DH-PSF納米分辨顯微成像系統(tǒng)49-56
• 2.6.1 系統(tǒng)設(shè)計(jì)49-50
• 2.6.2 系統(tǒng)標(biāo)定50-52
• 2.6.3 系統(tǒng)精度計(jì)算52-53
• 2.6.4 圖像重構(gòu)53-55
• 2.6.5 多個(gè)熒光分子的三維成像55-56
• 2.7 本章小結(jié)56-58
• 第3章 大景深三維成像技術(shù)58-74
• 3.1 基于擴(kuò)展景深的三維成像技術(shù)58-64
• 3.1.1 光學(xué)切趾術(shù)59-60
• 3.1.2 波前編碼技術(shù)60-61
• 3.1.3 圖像融合技術(shù)61-62
• 3.1.4 變焦透鏡技術(shù)62-64
• 3.2 變形光柵的理論基礎(chǔ)及成像模擬64-68
• 3.3 變形光柵的成像特性68-72
• 3.3.1 相位型變形光柵的設(shè)計(jì)原理69-70
• 3.3.2 波長(zhǎng)對(duì)衍射效率的影響70-72
• 3.4 本章小結(jié)72-74
• 第4章 大景深三維納米分辨多分子追蹤系統(tǒng)74-98
• 4.1 DDCM系統(tǒng)的原理75-82
• 4.1.1 DDCM的理論設(shè)計(jì)77-81
• 4.1.2 DDCM的定位精度模擬分析81-82
• 4.2 DDCM系統(tǒng)的搭建82-86
• 4.2.1 具有DH-PSF與變形光柵功能的復(fù)合相位片的設(shè)計(jì)與制備82-85
• 4.2.2 大景深三維定位追蹤系統(tǒng)85-86
• 4.3 系統(tǒng)的標(biāo)定86-87
• 4.4 系統(tǒng)的定位精度分析87-90
• 4.5 影響定位精度的因素90-92
• 4.6 基于DDCM系統(tǒng)的多分子追蹤實(shí)驗(yàn)92-97
• 4.6.1 多分子追蹤實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證92-93
• 4.6.2 多分子布朗運(yùn)動(dòng)的三維追蹤和軌跡重構(gòu)93-97
• 4.7 本章小結(jié)97-98
• 第5章 活細(xì)胞內(nèi)多分子追蹤的實(shí)驗(yàn)研究98-111
• 5.1 樣品制備98-101
• 5.2 動(dòng)態(tài)追蹤的實(shí)驗(yàn)結(jié)果101-106
• 5.2.1 基于DH-PSF系統(tǒng)的多分子追蹤實(shí)驗(yàn)101-104
• 5.2.2 基于DDCM系統(tǒng)的多分子追蹤實(shí)驗(yàn)104-106
• 5.3 結(jié)果分析106-110
• 5.3.1 細(xì)胞篩選106-107
• 5.3.2 細(xì)胞處理107-108
• 5.3.3 實(shí)驗(yàn)條件108-109
• 5.3.4 探測(cè)器性能109-110
• 5.4 本章小結(jié)110-111
• 第6章 總結(jié)與展望111-114
• 參考文獻(xiàn)114-122
• 致謝122-123
• 攻讀博士學(xué)位期間的研究成果123-124

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 于斌;李恒;陳丹妮;牛憨笨;;用于大景深三維納米分辨多分子追蹤的衍射光學(xué)元件的設(shè)計(jì)制備和實(shí)驗(yàn)研究[J];物理學(xué)報(bào);2013年15期

  本文關(guān)鍵詞：用于活體細(xì)胞內(nèi)多分子追蹤的大景深納米分辨方法和實(shí)驗(yàn)研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：427111