發(fā)布時(shí)間：2017-05-29 19:09

  本文關(guān)鍵詞：細(xì)胞miRNA抑制豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）復(fù)制的相關(guān)研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)可引起母豬晚期流產(chǎn)和仔豬呼吸疾病等臨床癥狀。由于該病的病原豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)具有較高的變異性,且可造成持續(xù)性感染和免疫抑制,因而疫苗免疫防控比較困難。近年來(lái),越來(lái)越多的證據(jù)表明宿主細(xì)胞micro RNA(mi RNA)是機(jī)體先天性/獲得性免疫以及宿主-病原體相互作用的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)中不可或缺的調(diào)節(jié)因子。通過(guò)直接結(jié)合病毒RNA抑制基因表達(dá)或間接作用于某個(gè)細(xì)胞成分進(jìn)而影響細(xì)胞內(nèi)通路和調(diào)節(jié)先天性免疫應(yīng)答,mi RNA在抗病毒感染和復(fù)制方面也扮演了重要的角色。為篩選具有抑制PRRSV復(fù)制潛在功效的mi RNA,我們合成了15條mi RNA模擬物,其序列在不同物種之間具有高度保守性,且已有相關(guān)文獻(xiàn)表明它們?cè)谙忍煨悦庖吆?或抗病毒方面具有一定功效。本研究利用體外轉(zhuǎn)染mi RNA模擬物或陰性對(duì)照后再感染相同劑量病毒的方法鑒定具有抗PRRSV作用的mi RNA,并從病毒學(xué)水平、基因組復(fù)制水平和蛋白翻譯水平證明其抑制作用,并進(jìn)一步發(fā)掘其發(fā)揮作用的機(jī)制。結(jié)果表明,15條候選mi RNA中僅有mi R-26a可以強(qiáng)烈抑制PRRSV的復(fù)制。體外過(guò)表達(dá)mi R-26a對(duì)不同毒力、不同基因型的PRRSV毒株均有抑制作用,且作用的強(qiáng)弱與轉(zhuǎn)染劑量在一定范圍內(nèi)呈正相關(guān)。突變mi R-26a種子區(qū)(Seed Region)可恢復(fù)病毒滴度,然而突變種子區(qū)以外局域并不影響其抑制作用。通過(guò)熒光素酶報(bào)告基因試驗(yàn),我們發(fā)現(xiàn)mi R-26a不能直接作用于PRRSV基因組RNA。另一方面,過(guò)表達(dá)mi R-26a可以顯著上調(diào)I型干擾素和干擾素刺激基因MX1、ISG15的表達(dá),這表明mi R-26a可能通過(guò)調(diào)控I型干擾素通路進(jìn)一步發(fā)揮抗PRRSV感染作用。隨后,我們利用生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)了PRRSV v JX143基因組上潛在的mi RNA靶位點(diǎn),結(jié)果發(fā)現(xiàn)其5’末端第155-162位核苷酸與mi R-130種子區(qū)以7mer-m8的結(jié)合方式完全互補(bǔ)配對(duì)。經(jīng)序列比對(duì)分析,其保守性在21株具有代表性的北美型毒株中達(dá)100%,而在3株歐洲型毒株中卻并不存在。恰如預(yù)料的是,轉(zhuǎn)染mi R-130家族,尤其是mi R-130b可以顯著抑制PRRSV的體外復(fù)制。我們還發(fā)現(xiàn)這種抑制作用表現(xiàn)在多株北美型病毒,而對(duì)歐洲株無(wú)效。熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)證明,mi R-130b可以顯著降低p GL3-5UTR熒光素酶的活性。同時(shí),mi R-130b不激活PAM細(xì)胞中IFN-α和TNF-α中的表達(dá),揭示mi R-130的抗PRRSV作用是通過(guò)直接靶向PRRSV特異性的結(jié)合位點(diǎn),而非激活先天性免疫來(lái)實(shí)現(xiàn)的。另外,作為一種無(wú)抗原性的小分子,mi RNA被認(rèn)為在抗病毒治療應(yīng)用中具有潛在功效。通過(guò)動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),滴鼻給藥mi R-130b可以明顯緩解臨床癥狀和病毒血癥,同時(shí)形成部分免疫保護(hù)效果。本論文的最后部分,我們通過(guò)深度測(cè)序鑒定了PRRSV感染MARC-145細(xì)胞后mi RNA表達(dá)譜,并進(jìn)行了差異分析。結(jié)果可以看出,類(lèi)似很多物種,mi R-21是MARC-145細(xì)胞中含量最豐富的mi RNA。PRRSV感染后,可以對(duì)MARC-145內(nèi)源的mi RNA表達(dá)產(chǎn)生影響。已經(jīng)確定了多種細(xì)胞mi RNA,其表達(dá)在PRRSV感染后發(fā)生顯著改變,其中很多mi RNA在前人研究中與機(jī)體先天性免疫等息息相關(guān)。這表明,mi RNA可能在PRRSV復(fù)制和宿主防御感染中發(fā)揮著功能。在PRRSV基因組序列范圍內(nèi),我們沒(méi)有找到任何潛在的mi RNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)存在的證據(jù)。根據(jù)不同mi RNA在細(xì)胞中的表達(dá)量,我們選取了六條分別呈高、中、低豐度表達(dá)的mi RNA作為研究對(duì)象,利用北美型PRRSV全長(zhǎng)感染性克隆p APRRS的平臺(tái),將mi RNA的反向互補(bǔ)序列插入PRRSV基因組3’UTR中,構(gòu)建了一系列PRRSV突變體,人工提供了與內(nèi)源性mi RNA序列完全互補(bǔ)的結(jié)合位點(diǎn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),插入let-7e結(jié)合位點(diǎn)后,可以在轉(zhuǎn)染后顯著抑制病毒產(chǎn)生的時(shí)間和復(fù)制的速率,但遺憾的是突變病毒遺傳不穩(wěn)定。盡管如此,我們還是獲得了一定試驗(yàn)數(shù)據(jù),插入互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)也不失為利用內(nèi)源mi RNA抑制PRRSV復(fù)制的一個(gè)研究思路,可通過(guò)更多嘗試以尋找一株復(fù)制能力較弱且穩(wěn)定遺傳的PRRSV,用于抗病毒治療的研究。綜上所述,本研究為宿主細(xì)胞mi RNA與PRRSV復(fù)制相互作用提供了三方面的試驗(yàn)數(shù)據(jù),證實(shí)mi R-26a、mi R-130家族的抗PRRSV作用及其機(jī)制,同時(shí)構(gòu)建了PRRSV感染MARC-145細(xì)胞后mi RNA表達(dá)譜,并對(duì)利用細(xì)胞內(nèi)源mi RNA抑制PRRSV復(fù)制的策略進(jìn)行了初步探索。
【關(guān)鍵詞】：豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒 miR-26a miR-130b miRNA表達(dá)譜 病毒復(fù)制
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：S852.651
【目錄】：

• 摘要6-8
• Abstract8-16
• 英文縮略表16-17
• 第一章 緒論17-35
• 1.1 豬繁殖與呼吸綜合征病毒概述17
• 1.2 PRRSV病原學(xué)研究進(jìn)展17-22
• 1.2.1 PRRSV基因組結(jié)構(gòu)17-18
• 1.2.2 PRRSV基因組復(fù)制與亞基因組轉(zhuǎn)錄18-19
• 1.2.3 PRRSV非結(jié)構(gòu)蛋白與結(jié)構(gòu)蛋白19-21
• 1.2.4 PRRSV細(xì)胞嗜性與入侵21-22
• 1.3 PRRSV持續(xù)性感染與先天性免疫22-24
• 1.4 Micro RNA研究概述24-28
• 1.4.1 Micro RNA的發(fā)現(xiàn)與定義24
• 1.4.2 Micro RNA的生物學(xué)發(fā)生24-25
• 1.4.3 Micro RNA的作用特征25-28
• 1.5 Micro RNA識(shí)別及靶基因預(yù)測(cè)28-29
• 1.6 宿主mi RNA與病毒相互作用29-34
• 1.6.1 病毒感染對(duì)mi RNA表達(dá)譜的影響30
• 1.6.2 mi RNA對(duì)病毒復(fù)制的影響30-32
• 1.6.3 利用mi RNA影響病毒嗜性32-33
• 1.6.4 mi RNA與PRRSV33-34
• 1.7 本研究目的和意義34-35
• 第二章 mi R-26a通過(guò)激活I(lǐng)型干擾素通路抑制PRRSV復(fù)制35-57
• 2.1 材料與方法35-47
• 2.1.1 細(xì)胞與病毒35-36
• 2.1.2 mi RNA模擬體（mimics）36-37
• 2.1.3 主要試劑37
• 2.1.4 主要儀器37
• 2.1.5 mi RNA mimics轉(zhuǎn)染和病毒多步生長(zhǎng)曲線37-38
• 2.1.6 間接免疫熒光試驗(yàn)（IFA）38
• 2.1.7 SDS-PAGE和Western Blotting38
• 2.1.8 RNA分離提取和實(shí)時(shí)定量PCR（q RT-PCR）38-42
• 2.1.9 熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒的構(gòu)建及熒光素酶試驗(yàn)42-47
• 2.1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析47
• 2.2 結(jié)果47-55
• 2.2.1 mi R-26a具有抗PRRSV作用47-49
• 2.2.2 mi R-26a對(duì)不同基因型和不同毒力的PRRSV毒株均有抑制作用49-50
• 2.2.3 mi R-26a對(duì)PRRSV的抑制作用與劑量相關(guān)50-51
• 2.2.4 mi R-26家族在PAM細(xì)胞上抑制PRRSV復(fù)制51-52
• 2.2.5 種子區(qū)序列對(duì)于mi R-26發(fā)揮抗PRRSV作用是必需的52-53
• 2.2.6 PAM細(xì)胞感染PRRSV引起mi R-26a/b上調(diào)53
• 2.2.7 mi R-26a不與PRRSV基因組直接結(jié)合53
• 2.2.8 mi R-26a上調(diào)I型干擾素及干擾素刺激基因的表達(dá)53-55
• 2.3 討論55-57
• 第三章 細(xì)胞mi R-130抗PRRSV感染的相關(guān)研究57-75
• 3.1 材料與方法57-64
• 3.1.1 細(xì)胞、病毒和質(zhì)粒57
• 3.1.2 試劑和儀器57-58
• 3.1.3 mi RNA的合成58
• 3.1.4 mi RNA轉(zhuǎn)染和病毒多步生長(zhǎng)曲線58
• 3.1.5 間接免疫熒光試驗(yàn)（IFA）58
• 3.1.6 SDS-PAGE和Western Blotting58-59
• 3.1.7 RNA分離提取和實(shí)時(shí)定量PCR（q RT-PCR）59
• 3.1.8 Taqman探針一步法熒光定量RT-PCR59-61
• 3.1.9 mi R-130靶位點(diǎn)的驗(yàn)證61
• 3.1.10 動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)61-64
• 3.2 結(jié)果64-73
• 3.2.1 軟件預(yù)測(cè)PRRSV 5’UTR含有mi R-130潛在結(jié)合位點(diǎn)64-65
• 3.2.2 mi R-130家族均具有抗PRRSV作用65-66
• 3.2.3 mi R-130b對(duì)PRRSV復(fù)制的抑制作用最強(qiáng)66
• 3.2.4 mi R-130b抑制PRRSV N蛋白表達(dá)66-67
• 3.2.5 mi R-130b抑制作用的強(qiáng)弱與劑量相關(guān)67-68
• 3.2.6 mi R-130b對(duì)不同北美型PRRSV均有抑制作用68-69
• 3.2.7 mi R-130b直接靶向北美型PRRSV 5’ UTR69-70
• 3.2.8 mi R-130b不激活I(lǐng)FN-α 和TNF-α70-71
• 3.2.9 mi R-130b抗PRRSV感染的體內(nèi)試驗(yàn)71-73
• 3.3 討論73-75
• 第四章 利用細(xì)胞內(nèi)源mi RNA影響PRRSV復(fù)制的初步探索75-85
• 4.1 材料與方法75-80
• 4.1.1 細(xì)胞、質(zhì)粒與細(xì)菌75
• 4.1.2 主要試劑75
• 4.1.3 主要儀器75
• 4.1.4 病毒感染和總RNA提取75-76
• 4.1.5 小RNA深度測(cè)序及數(shù)據(jù)分析76
• 4.1.6 mi RNA選取與引物設(shè)計(jì)76-77
• 4.1.7 突變病毒構(gòu)建77-79
• 4.1.8 突變病毒拯救79
• 4.1.9 間接免疫熒光試驗(yàn)（IFA）79
• 4.1.10 病毒多步生長(zhǎng)曲線79-80
• 4.1.11 突變病毒傳代及測(cè)序80
• 4.2 結(jié)果80-84
• 4.2.1 深度測(cè)序小RNA文庫(kù)的特征80-81
• 4.2.2 PRRSV感染前后mi RNA表達(dá)的差異81-82
• 4.2.3 定位在病毒基因組的vs RNA分布82
• 4.2.4 突變病毒N蛋白檢測(cè)82
• 4.2.5 突變病毒生長(zhǎng)曲線82-83
• 4.2.6 突變病毒遺傳穩(wěn)定性83-84
• 4.3 討論84-85
• 第五章 全文結(jié)論85-86
• 參考文獻(xiàn)86-100
• 致謝100-101
• 作者簡(jiǎn)介101

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  本文關(guān)鍵詞：細(xì)胞miRNA抑制豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）復(fù)制的相關(guān)研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：405522