基因組靶向修飾技術(shù)對基因功能研究、基因治療以及轉(zhuǎn)基因育種研究等都具有重要的意義和價值,其中,特異性核酸內(nèi)切酶的開發(fā)是基因組靶向修飾研究中的關(guān)鍵。鋅指核酸酶(ZFNs)和轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應物核酸酶(TALENs)的發(fā)展為基因組靶向修飾研究提供了有效的技術(shù)手段。但是,特異性高效ZFNs的復雜篩選和TALENs的繁瑣組裝過程依舊是一個重大的技術(shù)挑戰(zhàn),并嚴重制約著動物基因編輯育種研究等相關(guān)領(lǐng)域的發(fā)展速度;因此,亟待開發(fā)一種經(jīng)濟高效、簡單快捷、能夠應用于哺乳動物的特異性核酸內(nèi)切酶技術(shù)。2012年,源于釀膿鏈球菌的II型CRISPR/Cas免疫系統(tǒng)被首次在體外研究中應用于DNA分子的靶向切割,引發(fā)了業(yè)界的廣泛關(guān)注。而早在2011年,嗜熱鏈球菌的II型CRISPR/Cas系統(tǒng)CRISPR3就已經(jīng)被證明能在大腸桿菌中特異性的切割外源質(zhì)粒DNA。本研究在這種背景下展開,我們希望以嗜熱鏈球菌CRISPR3系統(tǒng)為基礎(chǔ),開發(fā)一種新型的核酸酶技術(shù),為以后進一步的基因組靶向修飾和動物基因編輯育種研究奠定基礎(chǔ)。本研究中我們首先成功克隆得到了嗜熱鏈球菌的Cas9基因并成功實現(xiàn)了其在酵母中的表達。然后我們相繼建立了酵母...

【文章頁數(shù)】：128 頁

【學位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 文獻綜述
    1.1 基因組靶向修飾
    1.2 FokI介導的核酸酶技術(shù)
        1.2.1 鋅指核酸酶技術(shù)
        1.2.2 TALE核酸酶技術(shù)
    1.3 CRISPR/Cas9核酸酶技術(shù)
        1.3.1 細菌CRISPR/Cas免疫系統(tǒng)
        1.3.2 CRISPR/Cas9核酸酶技術(shù)的體外研究
        1.3.3 CRISPR/Cas9核酸酶技術(shù)的迅速崛起
        1.3.4 CRISPR/Cas9核酸酶技術(shù)的優(yōu)缺點
        1.3.5 CRISPR/Cas9衍生技術(shù)的開發(fā)
        1.3.6 不同來源的CRISPR/Cas平臺開發(fā)
    1.4 本研究的目的意義
第二章 酵母StCRISPR/Cas9系統(tǒng)的建立
    2.1 試驗材料
        2.1.1 菌種與培養(yǎng)基
        2.1.2 主要試劑和儀器
        2.1.3 引物序列
    2.2 試驗方法
        2.2.1 bStCas9基因克隆和酵母表達載體構(gòu)建
        2.2.2 StCas9蛋白在酵母中的表達檢測
        2.2.3 導向RNA酵母表達載體構(gòu)建
        2.2.4 導向RNA分子的設計
        2.2.5 基于Gal4的酵母報告載體構(gòu)建
        2.2.6 Gal4報告載體自修復效率檢測試驗
        2.2.7 StCRISPR/Cas9系統(tǒng)活性驗證酵母轉(zhuǎn)化試驗
        2.2.8 Gal4報告基因的修復檢測
    2.3 試驗結(jié)果
        2.3.1 bStCas9基因的克隆及表達
        2.3.2 Gal4報告載體自修復效率檢測結(jié)果
        2.3.3 StCRISPR/Cas9系統(tǒng)在酵母中的活性驗證
        2.3.4 Gal4報告基因的修復檢測
    2.4 討論
    2.5 本章小結(jié)
第三章 酵母中StCRISPR/Cas9系統(tǒng)的優(yōu)化
    3.1 材料與方法
        3.1.1 試驗材料
        3.1.2 酵母轉(zhuǎn)化試驗
        3.1.3 sgRNA不同結(jié)構(gòu)域的優(yōu)化
        3.1.4 StCRISPR/Cas9脫靶效應研究
        3.1.5 StCRISPR/Cas9靶序列偏好性研究
        3.1.6 PAM序列的研究
        3.1.7 sgRNA的優(yōu)化設計和功能驗證
        3.1.8 StCas9密碼子優(yōu)化和功能驗證
    3.2 試驗結(jié)果
        3.2.1 sgRNA不同結(jié)構(gòu)域的優(yōu)化結(jié)果
        3.2.2 StCRISPR/Cas9脫靶效應研究結(jié)果
        3.2.3 StCRISPR/Cas9靶序列偏好性研究結(jié)果
        3.2.4 PAM序列的研究結(jié)果
        3.2.5 優(yōu)化后sgRNA的功能驗證
    3.3 討論
    3.4 本章小結(jié)
第四章 StCRISPR/Cas9系統(tǒng)酵母基因組打靶驗證
    4.1 材料與方法
        4.1.1 試驗材料
        4.1.2 整合型Gal4報告載體構(gòu)建
        4.1.3 酵母報告菌株構(gòu)建
        4.1.4 酵母報告菌株轉(zhuǎn)化試驗
        4.1.5 基因組中Gal4基因的修復檢測
    4.2 試驗結(jié)果
        4.2.1 酵母報告菌株的構(gòu)建和鑒定
        4.2.2 不同SSA同源臂長度的報告菌株比較
        4.2.3 基因組中Gal4基因修復的檢測結(jié)果
        4.2.4 StCRISPR/Cas9酵母基因組水平的打靶驗證
    4.3 討論
    4.4 本章小結(jié)
第五章 哺乳動物StCRISPR/Cas9系統(tǒng)的建立
    5.1 試驗材料
        5.1.1 細胞系與培養(yǎng)基
        5.1.2 主要試劑和儀器
        5.1.3 引物序列
    5.2 試驗方法
        5.2.1 StCas9哺乳動物表達載體構(gòu)建
        5.2.2 不同策略的導向RNA表達載體構(gòu)建
        5.2.3 SSA介導的eGFP報告載體構(gòu)建
        5.2.4 細胞轉(zhuǎn)染試驗
        5.2.5 流式細胞術(shù)檢測與分析
    5.3 試驗結(jié)果
        5.3.1 哺乳動物StCRISPR/Cas9活性驗證系統(tǒng)的建立
        5.3.2 不同導向RNA表達策略的比較
        5.3.3 優(yōu)化后sgRNA.Opti在HEK293中的活性驗證
        5.3.4 StCRISPR/Cas9對鼠ROSA26靶序列的打靶驗證
    5.4 討論
    5.5 本章小結(jié)
第六章 StCRISPR/Cas9系統(tǒng)HEK293T細胞基因組打靶研究
    6.1 材料與方法
        6.1.1 試驗材料
        6.1.2 整合型eGFP報告載體構(gòu)建
        6.1.3 HEK293T報告細胞系構(gòu)建
        6.1.4 HEK293T報告細胞系轉(zhuǎn)染試驗
        6.1.5 報告細胞系中的基因組打靶檢測
        6.1.6 HEK293T內(nèi)源基因打靶載體構(gòu)建及活性驗證
        6.1.7 RPG雙報告基因載體構(gòu)建
        6.1.8 HEK293T內(nèi)源基因打靶及突變檢測
    6.2 試驗結(jié)果
        6.2.1 HEK293報告細胞系基因組打靶驗證結(jié)果
        6.2.2 HEK293T內(nèi)源基因打靶載體活性驗證結(jié)果
        6.2.3 核酸酶陽性細胞的RPG富集
        6.2.4 HEK293T內(nèi)源基因的突變檢測結(jié)果
    6.3 討論
    6.4 本章小結(jié)
結(jié)論與創(chuàng)新點
參考文獻
附錄
縮略 詞
致謝
作者簡介



本文編號：3908459