隨著測序技術(shù)以及大數(shù)據(jù)信息科學(xué)的發(fā)展,越來越多導(dǎo)致疾病的基因突變已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)。不僅如此,如今的技術(shù)已經(jīng)可以預(yù)測一些疾病的發(fā)生可能與基因組上哪些DNA突變相關(guān)。然而,需要驗證預(yù)測的結(jié)果,或是對已經(jīng)發(fā)生的基因突變進(jìn)行治療,就必須依靠基因編輯技術(shù)。傳統(tǒng)的基因改造技術(shù)以基因打靶或是化學(xué)誘變(如乙烷亞硝基脲)為主。前者依賴于胚胎干細(xì)胞自發(fā)性同源重組反應(yīng),而后者通過誘導(dǎo)隨機(jī)性的突變進(jìn)而再篩選出需要的突變。兩者都需要投入相當(dāng)?shù)臅r間和精力,況且有些物種還沒有完整的胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)體系,難以在日常的研究中廣泛使用。近十年來,ZFN和TALEN人工核酸酶的出現(xiàn)改變了整個基因編輯領(lǐng)域過去的面貌。相對傳統(tǒng)的基因打靶技術(shù),ZFN和TALEN能夠快速地引起雙鏈DNA的斷鏈,而這種DNA損傷既能夠大大提高細(xì)胞內(nèi)自發(fā)同源重組發(fā)生的概率,也能夠簡單地敲除某一基因。通過向胚胎注射能結(jié)合目的序列的ZFN或TALEN的mRNA,人們曾突破性地成功在大鼠體內(nèi)實現(xiàn)了定點基因編輯。然而ZFN的特異有時受到相鄰模塊的影響,TALEN的DNA結(jié)合域存在大量的重復(fù)序列,給載體的構(gòu)建帶來相當(dāng)?shù)碾y度。就在TALEN技術(shù)出現(xiàn)后不久CRISPR/C...

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【文章目錄】：
摘要
Abstract
前言
第一章 體外表達(dá)重組Cas9蛋白以及活性檢測
    一 引言
    二 材料與方法
        2.1 主要實驗試劑與儀器
        2.2 實驗方法
    三 結(jié)果與討論
        3.1 His6-Cas9重組蛋白的體外純化
        3.2 His6MBP-Cas9重組蛋白的體外純化
        3.3 通過離子交換柱純化His6MBP-Cas9
        3.4 體外重組Cas9蛋白的功能鑒定
    四 結(jié)語
第二章 利用Cas9蛋白構(gòu)建帶有點突變的小鼠
    一 引言
    二 材料與方法
        2.1 主要實驗試劑與儀器
        2.2 實驗方法
    三 結(jié)果與討論
        3.1 His6-Cas9蛋白介導(dǎo)的點突變
        3.2 F1代小鼠基因型的鑒定
        3.3 重組ffis6-Cas9體內(nèi)脫靴活性的檢測
    四 結(jié)語
第三章 利用重組Cas9蛋白敲除基因組中長片段DNA
    一 引言
    二 材料與方法
        2.1 主要實驗試劑及儀器
        2.2 實驗方法
    三 結(jié)果與討論
        3.1 大鼠Fah基因的敲除
        3.2 小鼠體內(nèi)大片段DNA的敲除
    四 結(jié)語
第四章 Cas9蛋白介導(dǎo)的長片段DNA的整合及功能的鑒定
    一 引言
    二 材料與方法
        2.1 主要實驗試劑與儀器
        2.2 實驗方法
    三 結(jié)果與討論
        3.1 在Nfac1位點插入IRES-CreERT2-polyA及其功能的鑒定
        3.2 在大鼠的Lgr5位點插入Gene trap元件SA-GFP-pA并驗證其功能
    四 結(jié)語
第五章 問題與展望
第六章 綜述
參考文獻(xiàn)
科研成果
致謝



本文編號：3853359