本論文首先利用差速貼壁法分別從出生7天后(7 days post parturition,7dpp)的新生小鼠以及4周齡(4 Weeks,4W)的青春期小鼠卵巢中分離、富集OSCs,分別命名為7dpp-putative OSCs以及4W-putative OSCs,經(jīng)過體外培養(yǎng)傳代、細(xì)胞形態(tài)觀察、堿性磷酸酶染色、RT-PCR標(biāo)志基因表達(dá)水平檢測、細(xì)胞免疫熒光染色、體內(nèi)卵巢移植實驗以及轉(zhuǎn)錄組測序(RNA-seq)等技術(shù)手段,鑒定、分析從不同周齡小鼠卵巢中分離獲得的細(xì)胞生物學(xué)特性。實驗結(jié)果表明在體外培養(yǎng)過程中兩種細(xì)胞在形態(tài)上具有很大差異,7dpp-putative OSCs形成串狀克隆,細(xì)胞連接緊密,經(jīng)過傳代培養(yǎng)后細(xì)胞增殖聚集成簇;4W-putative OSCs部分細(xì)胞聚集形成較為立體的克隆,經(jīng)過傳代培養(yǎng)后克隆逐漸變?yōu)楸馄缴掀�。在基因表達(dá)水平上,7dpp-putative OSCs表達(dá)Oct4、Blimp1、Ddx4等生殖干細(xì)胞標(biāo)志基因及蛋白,而4W-putative OSCs不表達(dá)Blimp1基因,同時Oct4、Ddx4表達(dá)水平較低,但I(xiàn)fitm3、Cdh1表達(dá)水平較高。RNA-se...

【文章頁數(shù)】：109 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
縮略詞表
第一章 引言
    1.1 干細(xì)胞的定義
        1.1.1 胚胎早期發(fā)育與干細(xì)胞來源
        1.1.2 干細(xì)胞的分類與定義
    1.2 生殖干細(xì)胞
        1.2.1 生殖干細(xì)胞的定義
        1.2.2 精原干細(xì)胞的定義
        1.2.3 精原細(xì)胞的分類
        1.2.4 精原干細(xì)胞的增殖調(diào)控
    1.3 卵原干細(xì)胞
        1.3.1 卵原干細(xì)胞及其研究進(jìn)展
        1.3.2 卵原干細(xì)胞的特征
        1.3.3 卵原干細(xì)胞的增殖調(diào)控
        1.3.4 卵原干細(xì)胞體外分化形成卵母細(xì)胞的研究
        1.3.5 卵泡發(fā)育
        1.3.6 卵原干細(xì)胞的研究意義
第二章 OSCs體外分離建系及其生物學(xué)特性的研究
    2.1 實驗材料
        2.1.1 實驗動物
        2.1.2 實驗所用主要試劑的配置
    2.2 實驗方法
        2.2.1 飼養(yǎng)層細(xì)胞的準(zhǔn)備
        2.2.2 OSCs的分離、純化、培養(yǎng)
        2.2.4 OSCs的標(biāo)志基因蛋白以及堿性磷酸酶鑒定
        2.2.5 OSCs體內(nèi)分化形成卵子潛能的鑒定
        2.2.6 OSCs轉(zhuǎn)錄組測序分析
    2.3 實驗結(jié)果
        2.3.1 OSCs體外培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)
        2.3.2 NBT/BCIP染色鑒定OSCs堿性磷酸酶表達(dá)結(jié)果
        2.3.3 RT-PCR檢測OSCs標(biāo)志基因的表達(dá)
        2.3.4 免疫熒光染色檢測OSCs標(biāo)志蛋白表達(dá)
        2.3.5 OSCs體內(nèi)卵巢移植結(jié)果
        2.3.6 OSCs轉(zhuǎn)錄組測序分析結(jié)果
    2.4 討論
第三章 OSCs體外分化形成功能性卵母細(xì)胞的研究
    3.1 實驗材料
        3.1.1 實驗動物
        3.1.2 實驗所用主要溶液試劑的配置
    3.2 實驗方法
        3.2.1 OSCs與新生小鼠卵巢體細(xì)胞聚合形成聚合細(xì)胞團
        3.2.2 OSCs與卵巢體細(xì)胞形成聚合細(xì)胞團的體內(nèi)腎包膜下移植
        3.2.3 OSCs與卵巢體細(xì)胞形成聚合細(xì)胞團腎包膜下移植后雌激素的測定
        3.2.4 OSCs與卵巢體細(xì)胞聚合形成細(xì)胞團體內(nèi)腎包膜下移植后卵巢再生的檢測
        3.2.5 OSCs與卵巢體細(xì)胞聚合形成細(xì)胞團在體外培養(yǎng)形成重組卵巢
        3.2.6 MII期卵母細(xì)胞孤雌激活
        3.2.7 MII期卵母細(xì)胞體外單精注射
        3.2.8 胚胎移植及子代鑒定
        3.2.9 OSCs體外分化進(jìn)入減數(shù)分裂Sycp3 染色
        3.2.10 OSCs體外分化形成GV期卵子與體內(nèi)正常GV期卵子的轉(zhuǎn)錄組測序分析
        3.2.11 數(shù)據(jù)分析
    3.3 實驗結(jié)果
        3.3.1 OSCs與卵巢體細(xì)胞聚合形成細(xì)胞團體內(nèi)腎包膜下移植結(jié)果
        3.3.2 OSCs與卵巢體細(xì)胞聚合形成細(xì)胞團體內(nèi)腎包膜下移植雌激素分泌結(jié)果
        3.3.3 OSCs與卵巢體細(xì)胞體外共培養(yǎng)不同階段形成重組卵泡
        3.3.4 OSCs體外分化形成MII期卵母細(xì)胞形態(tài)及成熟率分析
        3.3.5 OSCs體外分化形成MII期卵母細(xì)胞孤雌激活后胚胎發(fā)育
        3.3.6 OSCs體外分化進(jìn)入減數(shù)分裂Sycp3 染色鑒定
        3.3.7 OSCs體外分化形成MII期卵母細(xì)胞ISCI后產(chǎn)生子代
        3.3.8 OSCs體外分化形成GV期卵母細(xì)胞形態(tài)
        3.3.9 OSCs體外分化形成GV期卵母細(xì)胞與體內(nèi)正常GV期卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析
    3.4 討論
第四章 OSCs、PGCs及 ESCs基因表達(dá)分析
    4.1 實驗材料
        4.1.1 實驗動物
        4.1.2 主要溶液配制
    4.2 實驗方法
        4.2.1 PGCs的獲得
        4.2.2 ESCs細(xì)胞培養(yǎng)
        4.2.3 OSCs細(xì)胞培養(yǎng)
        4.2.4 q-PCR檢測OSCs、PGCs和 ESCs基因表達(dá)
        4.2.5 轉(zhuǎn)錄組測序分析OSCs、PGCs及 ESCs差異基因表達(dá)
        4.2.6 數(shù)據(jù)分析
    4.3 實驗結(jié)果
        4.3.1 q-PCR檢測OSCs、PGCs和 ESCs差異基因表達(dá)
        4.3.2 轉(zhuǎn)錄組測序分析OSCs、PGCs和 ESCs基因表達(dá)
    4.4 討論
第五章 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝
攻讀博士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文及成果



本文編號：3823087