納米抗體,也稱為單域抗體或重鏈抗體可變區(qū),是一種分子量只有常規(guī)抗體十分之一大小,但仍具備較好抗原結(jié)合能力的抗體分子。因其具有結(jié)構(gòu)尺度小、生化性質(zhì)穩(wěn)定、易于原核表達等特點,在各類研究及應(yīng)用中引起了廣泛關(guān)注。為進一步拓展其應(yīng)用,納米抗體的修飾和固定化等改造至關(guān)重要。傳統(tǒng)化學(xué)修飾方法容易使納米抗體結(jié)構(gòu)受到影響甚至失去活性,所以須采用更為可控的定點修飾技術(shù)進行改造。但現(xiàn)有技術(shù)存在效率較低或步驟復(fù)雜等缺陷,因此,迫切需要發(fā)展一種簡便高效的定點修飾技術(shù)以滿足納米抗體的應(yīng)用需求。目前,由于融合標(biāo)簽小,操作簡便等優(yōu)點,甲酰甘氨酸生成酶(Formylglycine-generating enzyme,FGE)催化的蛋白質(zhì)定點醛基化修飾方法正在受到越來越多的關(guān)注。基于納米抗體的抗原結(jié)合域臨近N端,本文提出利用FGE催化對納米抗體的C端進行定點醛基化修飾,并探索了其在一步定點固定化、構(gòu)建C端-C端(C-C)連接二價抗體和以納米抗體為單體制備功能化冰膠整體材料方面的應(yīng)用,具體開展了以下四個方面的工作:(1)首先嘗試了在大腸桿菌胞內(nèi)共表達FGE以催化納米抗體定點醛基化修飾,但發(fā)現(xiàn)納米抗體的可溶表達和催化不能同時...

【文章頁數(shù)】：156 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
主要縮寫詞和符號表
1 緒論
    1.1 蛋白質(zhì)的修飾方法研究進展
        1.1.1 經(jīng)典化學(xué)修飾方法
        1.1.2 定點化學(xué)修飾方法
        1.1.3 酶法定點修飾方法
    1.2 定點醛基化修飾研究進展
        1.2.1 甲酰甘氨酸生成酶(Formylglycine-generating Enzyme,FGE)概述
        1.2.2 定點醛基化修飾的應(yīng)用
    1.3 納米抗體研究進展
        1.3.1 納米抗體概述
        1.3.2 納米抗體的應(yīng)用
    1.4 本文主要研究思路和內(nèi)容
2 甲酰甘氨酸生成酶胞內(nèi)催化目標(biāo)蛋白定點醛基化修飾用于無純化固定化
    2.1 引言
    2.2 材料與方法
        2.2.1 實驗材料和儀器
        2.2.2 融合Ald-tag的蛋白A重組表達載體的構(gòu)建
        2.2.3 共表達Ald-tag蛋白A和FGE的菌株構(gòu)建
        2.2.4 胞內(nèi)共表達FGE催化蛋白A醛基化修飾
        2.2.5 表面酰肼功能化瓊脂糖微球的制備
        2.2.6 蛋白濃度測定
        2.2.7 從細(xì)胞破碎上清液中一步固定化蛋白A的步驟
        2.2.8 醛基蛋白A填料對血清中IgG動態(tài)吸附的評價
        2.2.9 醛基蛋白A填料的穩(wěn)定性測試
    2.3 結(jié)果與討論
        2.3.1 蛋白A的體內(nèi)定點醛基化修飾
        2.3.2 從細(xì)胞破碎上清液中一步固定化蛋白A的評價
        2.3.3 不同細(xì)胞破碎上清液處理方式對固定化的影響
        2.3.4 醛基蛋白A填料對血清中IgG的動態(tài)吸附評價
        2.3.5 醛基蛋白A填料的穩(wěn)定性評價
    2.4 本章小結(jié)
3 甲酰甘氨酸生成酶體外催化納米抗體高效定點醛基化修飾
    3.1 引言
    3.2 材料與方法
        3.2.1 實驗材料和儀器
        3.2.2 FGE的表達與純化
        3.2.3 FGE體外催化納米抗體定點醛基化修飾與表征
        3.2.4 FGE體外催化條件優(yōu)化過程
        3.2.5 FGE肽指紋圖譜獲得與分析
        3.2.6 FGE及其突變體表征
        3.2.7 蛋白濃度測定
    3.3 結(jié)果與討論
        3.3.1 FGE的表達與純化
        3.3.2 FGE體外催化納米抗體定點醛基化修飾
        3.3.3 優(yōu)化的FGE體外催化條件
        3.3.4 FGE自體醛基化修飾現(xiàn)象的驗證
        3.3.5 FGE-C238A和-C239A突變體的表征
    3.4 本章小結(jié)
4 冷凍輔助合成C端-C端連接的二價及雙特異性納米抗體
    4.1 引言
    4.2 材料與方法
        4.2.1 實驗材料和儀器
        4.2.2 納米抗體及C-N連接二價納米抗體的表達與純化
        4.2.3 納米抗體體外定點醛基化修飾
        4.2.4 雙氧氨基接頭的合成
        4.2.5 高效液相法檢測二價納米抗體的生成
        4.2.6 冷凍條件下制備C-C連接的二價及雙特異性納米抗體
        4.2.7 透射電鏡觀察二價納米抗體復(fù)合物
        4.2.8 表面等離子體共振表征納米抗體及復(fù)合物的親和力
    4.3 結(jié)果與討論
        4.3.1 納米抗體的表達純化
        4.3.2 納米抗體的體外醛基化修飾
        4.3.3 冷凍條件下的二價納米抗體合成
        4.3.4 冷凍提高反應(yīng)速率的機理初探
        4.3.5 冷凍條件下合成雙特異性納米抗體
        4.3.6 納米抗體及其C-C,C-N連接復(fù)合物的親和力表征與對比
    4.4 本章小結(jié)
5 以納米抗體為單體原位聚合一鍋法制備多孔冰膠整體材料
    5.1 引言
    5.2 材料與方法
        5.2.0 實驗材料和儀器
        5.2.1 醛基化修飾的納米抗體連接含氨基化合物的方法與表征
        5.2.2 以納米抗體為單體原位聚合制備冰膠
        5.2.3 冰膠的表征
        5.2.4 原位聚合NB1冰膠對hβ2M的等溫吸附曲線測定
        5.2.5 冰膠對復(fù)雜體系中hβ2M的動態(tài)吸附表征
        5.2.6 冰膠的保存穩(wěn)定性表征
        5.2.7 蛋白濃度測定
    5.3 結(jié)果與討論
        5.3.1 醛基化修飾的納米抗體進一步連接含氨基化合物
        5.3.2 以納米抗體為單體與不同單體交聯(lián)劑體系共聚
        5.3.3 AAm-NB 1-PEGDA冰膠的結(jié)構(gòu)表征
        5.3.4 AAm-NB1-PEGDA冰膠對hβ2M的吸附
        5.3.5 AAm-NB1-PEGDA冰膠對細(xì)胞破碎上清中hβ2M的動態(tài)吸附
        5.3.6 AAm-NB1-PEGDA冰膠的保存穩(wěn)定性
    5.4 本章小結(jié)
6 結(jié)論與展望
    6.1 結(jié)論
    6.2 創(chuàng)新點
    6.3 展望
參考文獻
附錄A FGE、蛋白A及納米抗體氨基酸序列
附錄B 納米抗體及其多種復(fù)合物的SPR結(jié)合-解離曲線
附錄C 納米抗體NB1多種分子修飾質(zhì)譜鑒定
攻讀博士學(xué)位期間獲得的科研成果及參與的科研項目
致謝
作者簡介



本文編號：3816967