家蠶是重要的吐絲營繭昆蟲,也是生物研究的模式昆蟲之一。CRISPR/Cas9基因敲除系統(tǒng)是近兩年發(fā)展起來的一種來源于細(xì)菌獲得性免疫系統(tǒng)的基因編輯技術(shù),經(jīng)過人工的改造,目前已被廣泛運(yùn)用于多種模式生物的研究,成為一種強(qiáng)大的研究工具。本研究分別選擇了家蠶體壁等顏色相關(guān)和絲腺發(fā)育相關(guān)的兩類基因,利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除基因后獲得突變體,成功建立了一套高效快速的家蠶基因敲除技術(shù)體系,為家蠶功能基因組學(xué)的研究提供了一個(gè)有力的工具。同時(shí),對敲除了絲腺相關(guān)基因的家蠶個(gè)體進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序RNA-seq,初步闡釋了家蠶絲腺發(fā)育的分子機(jī)制。主要結(jié)果如下：1.運(yùn)用CRISPR/Cas9系統(tǒng)成功敲除了家蠶4個(gè)與體壁等透明性及顏色相關(guān)的基因Bm-ok、BmKMO、BmTH、Bmtan。根據(jù)靶點(diǎn)設(shè)計(jì)原則,對這4個(gè)基因共設(shè)計(jì)了8個(gè)靶點(diǎn),其中BmTH3個(gè),Bm-ok, Bmtan各2個(gè),BmKMO僅1個(gè)靶點(diǎn)。將體外合成的高質(zhì)量的Cas9-mRNA和sgRNA混合后顯微注射到家蠶剛產(chǎn)的卵內(nèi),結(jié)果表明這8個(gè)靶點(diǎn)的sgRNA均發(fā)揮了敲除效應(yīng),敲除的突變率大概為16.7%-35.0%,但不同基因不同靶點(diǎn)的突變率不同,...

【文章頁數(shù)】：111 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
中文摘要
Abstract
主要英文縮寫與譯名
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1. 引言
    2. CRISPR/Cas系統(tǒng)介紹
        2.1 CRISPR/Cas系統(tǒng)的來源
        2.2 CRISPR/Cas系統(tǒng)的組成和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)
            2.2.1 CRISPR結(jié)構(gòu)
            2.2.2 Cas基因
            2.2.3 CRISPR/Cas系統(tǒng)的分類
        2.3 CRISPR/Cas系統(tǒng)的工作機(jī)理
    3. CRISPR/Cas9系統(tǒng)的應(yīng)用
        3.1 CRISPR/Cas9研究現(xiàn)狀
        3.2 CRISPR/Cas9在基因編輯中的應(yīng)用
        3.3 CRISPR/Cas9敲除基因的機(jī)制
        3.4 CRISPR/Cas9脫靶效應(yīng)
        3.5 CRISPR/Cas9其他方面的應(yīng)用
    4. 家蠶絲腺介紹
        4.1 家蠶絲腺的形態(tài)特點(diǎn)與功能
        4.2 家蠶絲腺的組織結(jié)構(gòu)
        4.3 家蠶絲腺的發(fā)育概況
            4.3.1 家蠶絲腺發(fā)育的基本過程
            4.3.2 家蠶絲腺發(fā)育的分子機(jī)理
    5. 家蠶Bmsage基因研究概況
    6. 反向遺傳學(xué)技術(shù)
    7. 第二代高通量測序技術(shù)
    8. 研究目的及意義
    9. 主要內(nèi)容
        9.1 利用CRISPR/Cas9研究家蠶體壁等相關(guān)基因的功能
        9.2 利用CRISPR/Cas9研究家蠶絲腺相關(guān)基因的功能
    10. 技術(shù)路線
第二章 利用CRISPR/Cas9研究家蠶體壁相關(guān)基因的功能
    1. 引言
    2. 實(shí)驗(yàn)材料與方法
        2.1 實(shí)驗(yàn)材料
            2.1.1 家蠶
            2.1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器
            2.1.3 主要試劑和試劑盒
            2.1.4 主要試劑的配制
            2.1.5 DNA測序
        2.2 實(shí)驗(yàn)方法
            2.2.1 蠶卵滯育性的解除
            2.2.2 CRISPR/Cas9靶點(diǎn)設(shè)計(jì)
            2.2.3 所選基因靶點(diǎn)序列的確認(rèn)
            2.2.4 Cas9-mRNA的體外合成
            2.2.5 sgRNA的體外合成
            2.2.6 家蠶卵的顯微注射
            2.2.7 突變率和突變類型的檢測
            2.2.8 脫靶效應(yīng)的檢測
            2.2.9 突變體表型篩選
            2.2.10 蛾子交配策略
    3. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.1 Bm-ok敲除結(jié)果
        3.2 BmKMO、BmTH和Bmtan敲除結(jié)果
        3.3 脫靶效應(yīng)的檢測
    4. 討論
第三章 利用CRISPR/Cas9研究家蠶絲腺發(fā)育相關(guān)基因的功能
    1. 引言
    2. 實(shí)驗(yàn)材料與方法
        2.1 實(shí)驗(yàn)材料
            2.1.1 家蠶
            2.1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器
            2.1.3 主要試劑和試劑盒
            2.1.4 DNA測序
        2.2 實(shí)驗(yàn)方法
            2.2.1 Bmsage注射死胚的檢測
            2.2.2 Bmsage G₀代蛾子的檢測
            2.2.3 Bmsage突變體篩選和表型分析
            2.2.4 Bmsage突變體表型的確認(rèn)
    3. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.1 Bmsage靶點(diǎn)設(shè)計(jì)及確認(rèn)
        3.2 Bmsage突變率
        3.3 Bmsage突變體表型的分析和篩選
            3.3.1 Bmsage G₀代蛾子的交配
            3.3.2 Bmsage G₁代突變體篩選
            3.3.3 Bmsage G₂代純合突變體篩選
            3.3.4 Bmsage突變體表型分析
            3.3.5 Bmsage突變體胚胎期絲腺形態(tài)
            3.3.6 不同基因型的Bmsage突變體篩選
        3.4 Bmsage突變體化蛹期的生長情況
        3.5 Bmsage突變體蛾子生長情況
        3.6 Bmsage敲除的脫靶效應(yīng)
    4. 討論
第四章 家蠶Bmsage絲腺缺失突變體的RNA-seq分析
    1. 引言
    2. 實(shí)驗(yàn)材料與方法
        2.1 實(shí)驗(yàn)材料
            2.1.1 家蠶
            2.1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器
            2.1.3 主要試劑
        2.2 實(shí)驗(yàn)方法
            2.2.1 樣品制備和上機(jī)測序
            2.2.2 測序數(shù)據(jù)生物信息學(xué)分析
            2.2.3 qRT-PCR驗(yàn)證基因表達(dá)水平
    3. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.1 RNA-seq數(shù)據(jù)預(yù)處理
        3.2 qRT-PCR驗(yàn)證結(jié)果
        3.3 差異基因分析與篩選
        3.4 差異基因的GO、KEGG信號通路分析
            3.4.1 差異基因的GO分析
            3.4.2 差異基因的KEGG信號通路分析
            3.4.3 差異基因的WEGO分析
    4. 討論
第五章 結(jié)論及后續(xù)研究展望
    1. 主要結(jié)論
    2. 創(chuàng)新點(diǎn)
    3. 后續(xù)研究展望
參考文獻(xiàn)
附錄
    1. 攻讀博士學(xué)位期間發(fā)表論文
    2. 參與課題
致謝



本文編號：3736337