本文關(guān)鍵詞：造血干細(xì)胞對(duì)小鼠Kupffer細(xì)胞池的維持作用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景和目的：聯(lián)合應(yīng)用原位膠原酶灌注、離體消化和密度梯度離心是分離Kupffer細(xì)胞的常用方法,然而傳統(tǒng)的兩層密度梯度離心法不能有效去除非活性細(xì)胞成分,以致形成非特異性染色影響流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果。本研究的目的是根據(jù)不同肝臟非實(shí)質(zhì)細(xì)胞的密度設(shè)計(jì)多層密度梯度離心法以制備更適用于流式細(xì)胞儀檢測(cè)的肝臟非實(shí)質(zhì)細(xì)胞標(biāo)本。 材料和方法:在通過(guò)原位膠原酶灌注和離體消化分離肝臟細(xì)胞后,應(yīng)用質(zhì)量體積濃度分別為7.2%、11.2%、13.2%及18%的OptiPrepTM密度梯度液分離肝臟非實(shí)質(zhì)細(xì)胞,利用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)離心后各密度分層界面所得細(xì)胞群中Kupffer細(xì)胞比例及7-AAD熒光染色陽(yáng)性的非活性Kupffer田胞比例。選擇活性Kupffer細(xì)胞比例最高的細(xì)胞群與經(jīng)典兩層密度梯度離心法(11.5%及17.6%OptiPrepTM密度梯度液)比較,觀察兩種方法所得樣本中upffer田胞得率、F4/80抗原平均熒光強(qiáng)度及樣本非特異性染色比例的差異。 結(jié)果:離心后沿密度梯度共形成四組可見(jiàn)的細(xì)胞群,其中位于7.2%／11.2%OptiPrepTM密度梯度液分界層面的細(xì)胞群Kupffer細(xì)胞占非淋巴性肝非實(shí)質(zhì)細(xì)胞比例及活性Kupffer細(xì)胞比例最高(P0.05)。與兩層密度梯度離心法相比,四層密度梯度離心法所得樣本中Kupffer得率更高、PE耦聯(lián)F4/80平均熒光強(qiáng)度更高,同時(shí)樣本非特異性染色比例更低(P0.05) 結(jié)論:改良的四層密度梯度離心法可以有效提高非淋巴性肝臟非實(shí)質(zhì)細(xì)胞及Kupffer細(xì)胞的細(xì)胞得率,減少流式細(xì)胞分析中非活性成分引起的非特異性染色。背景和目的：經(jīng)典理論認(rèn)為Kupffer細(xì)胞依靠單核細(xì)胞介導(dǎo)來(lái)源于骨髓造血干細(xì)胞,而近期研究提出Kupffer細(xì)胞起源于胚胎卵黃囊前體細(xì)胞,且在成年期長(zhǎng)期依靠自身更新維持細(xì)胞數(shù)量,但這兩種理論均無(wú)法解釋綠色熒光蛋白(Green Fluorescent Protein, GFP)嵌合小鼠體內(nèi)骨髓來(lái)源Kupffer田胞與原位Kupffer細(xì)胞并存的現(xiàn)象。本研究的目的為利用GFP標(biāo)記骨髓來(lái)源細(xì)胞,尤其是造血干細(xì)胞以追蹤其在小鼠Kupffer細(xì)胞受損時(shí)對(duì)維持正常Kupffer田胞數(shù)量的作用。材料和方法：建立肝臟屏蔽照射GFP骨髓嵌合小鼠模型,利用流式細(xì)胞分析、熒光激活細(xì)胞分選(Fluorescence-activated cell sorting, FACS)技術(shù)及肝臟免疫熒光染色分別檢測(cè)在穩(wěn)態(tài)、放射線照射、氯膦酸鹽脂質(zhì)體清除Kupffer細(xì)胞以及四氯化碳誘導(dǎo)的急慢性肝臟炎癥時(shí)肝臟Kupffer細(xì)胞、骨髓造血干／前體細(xì)胞及血液?jiǎn)魏思?xì)胞的GFP表達(dá)情況通過(guò)高通量細(xì)胞表面標(biāo)志物篩選技術(shù)鑒定不同來(lái)源的巨噬細(xì)胞,并應(yīng)用過(guò)繼性細(xì)胞回輸技術(shù)對(duì)所得結(jié)果行進(jìn)一步驗(yàn)證。結(jié)果：肝臟屏蔽照射骨髓嵌合小鼠模型在骨髓移植后40周內(nèi)肝臟內(nèi)僅檢測(cè)出極少量GFP陽(yáng)性Kupffer細(xì)胞,且肝臟原有Kupffer細(xì)胞數(shù)量較照射前無(wú)明顯變化。當(dāng)受到放射線損傷時(shí),肝內(nèi)原有GFP陰性Kupffer田胞數(shù)量明顯減少,且在骨髓移植后40周內(nèi)未發(fā)現(xiàn)明顯增殖跡象,而損失的Kupffer細(xì)胞由骨髓來(lái)源的駐留型GFP陽(yáng)性巨噬細(xì)胞所補(bǔ)充。氯膦酸鹽脂質(zhì)體清除Kupffer細(xì)胞后及反復(fù)注射四氯化碳誘導(dǎo)肝臟慢性炎癥時(shí)也觀察到了相似的現(xiàn)象。但在單次四氯化碳誘導(dǎo)肝臟急性炎癥模型中,骨髓來(lái)源的巨噬細(xì)胞僅在肝臟內(nèi)短暫停留。這兩種骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞具有不同的基因表達(dá)及細(xì)胞表面標(biāo)志物,與表達(dá)單核細(xì)胞標(biāo)志物的遷移型巨噬細(xì)胞不同,駐留型巨噬細(xì)胞表達(dá)造血干細(xì)胞表面標(biāo)志物、可在應(yīng)用造血干細(xì)胞動(dòng)員劑時(shí)增多。同時(shí)用氯膦酸鹽脂質(zhì)體清除Kupffer細(xì)胞后,移植造血干細(xì)胞而非單核細(xì)胞可補(bǔ)充Kupffer細(xì)胞數(shù)量。結(jié)論：小鼠肝臟Kupffer細(xì)胞池的維持在穩(wěn)態(tài)時(shí)不依賴骨髓；而當(dāng)肝臟受損且Kupffer田胞數(shù)量減少時(shí),骨髓造血干細(xì)胞可通過(guò)單核細(xì)胞以外的途徑補(bǔ)充損失的Kupffer細(xì)胞。
【關(guān)鍵詞】：多層密度梯度離心 Kupffer細(xì)胞 非活性成分 骨髓嵌合小鼠模型 Kupffer細(xì)胞池 骨髓造血干細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：首都醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R329.2
【目錄】：

• 第一部分：四層密度梯度離心法制備用于流式細(xì)胞儀檢測(cè)的富含Kupffer細(xì)胞的肝臟非實(shí)質(zhì)細(xì)胞懸液4-24
• 摘要4-5
• Abstract5-7
• 前言7-8
• 材料與方法8-15
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果15-21
• 討論21-23
• 結(jié)論23-24
• 第二部分：造血干細(xì)胞對(duì)小鼠Kupffer細(xì)胞池的維持作用24-62
• 摘要24-26
• Abstract26-28
• 前言28-30
• 材料與方法30-41
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果41-57
• 討論57-61
• 結(jié)論61-62
• 文獻(xiàn)綜述62-69
• 參考文獻(xiàn)69-82
• 附錄82-83
• 期間發(fā)表文章情況83-84
• 致謝84-85
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷85

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 ;Isolation of murine hepatic lymphocytes using mechanical dissection for phenotypic and functional analysis of NK1.1~+ cells[J];World Journal of Gastroenterology;2004年13期

  本文關(guān)鍵詞：造血干細(xì)胞對(duì)小鼠Kupffer細(xì)胞池的維持作用，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：371636