發(fā)布時間：2022-03-10 13:41

　　大部分遺傳改變都存在一定的回復概率,一方面這些改變可能對某些不利的生長環(huán)境具有一定的抵抗作用,如:藥物處理條件,但當不利條件解除后,這些改變的存在可能對生物體的正常生長起抑制作用。因此,如何對多變的外界環(huán)境做出快速的遺傳改變從而適應環(huán)境,對生物體而言是一項重要的挑戰(zhàn)。我的研究在裂殖酵母中發(fā)現(xiàn)了一種可逆的介導抗藥性的遺傳突變---微型同源臂介導的串聯(lián)重復（簡稱為MTD）,其在一定的條件下能夠回復至野生型序列。因此,我對裂殖酵母基因組上一定條件范圍內所有的微型同源臂序列（MHPs）進行了注釋,發(fā)現(xiàn)MHP序列在基因組上普遍存在（～2.5×10⁷個）,提供大量的潛在MTD突變位點。MTD的頻率受到發(fā)生概率、回復概率、及適應性等方面共同作用。通過對10,000x全基因組測序結果進行MTD突變檢測,我在單細胞起源的細胞群體中發(fā)現(xiàn)了近6000個亞克隆MTDs突變位點;通過使用特殊的預測模型及高溫篩選策略,我初步了解了MTD的發(fā)生與回復是如何受調控的。根據(jù)模型預測結果,基因內發(fā)生MTD概率最高的MHP位點往往插入MTDs后不會改變基因的閱讀框,而基因組上大量MHPs的存在及可逆的... 

【文章來源】：浙江大學浙江省211工程院校985工程院校教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：105 頁

【學位級別】：博士

【文章目錄】：
致謝
摘要
Abstract
1.引言
    1.1 基因組不穩(wěn)定性
        1.1.1 介導基因組不穩(wěn)定性的突變類型
        1.1.2 調控基因組不穩(wěn)定性的相關機制
        1.1.3 基因組不穩(wěn)定性發(fā)生的“熱點”
    1.2 串聯(lián)重復序列
        1.2.1 串聯(lián)重復序列
        1.2.2 調控串聯(lián)重復序列不穩(wěn)定性的機制
        1.2.3 串聯(lián)重復序列的來源
    1.3 兩端帶有短同源序列的片段重復---具有微型同源臂的片段串聯(lián)重復
        1.3.1 微型同源臂介導的片段串聯(lián)重復
        1.3.2 微型同源臂介導的片段串聯(lián)重復可能的調控機制
    1.4 表觀基因組(Epigenome)不穩(wěn)定性
    1.5 雷帕霉素抗藥性與TOR通路
        1.5.1 雷帕霉素
        1.5.2 TOR通路上游調控因子
        1.5.3 TOR通路下游效應因子
2.材料與方法
    2.1 材料
        2.1.1 模式生物---栗酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces.pombe)
        2.1.2 菌株列表
        2.1.3 主要引物列表
        2.1.4 主要藥物與試劑
        2.1.5 相關溶液配制
        2.1.6 常用培養(yǎng)基所需材料與配方
        2.1.7 主要儀器設備
    2.2 方法
        2.2.1 常規(guī)PCR與重疊PCR
        2.2.2 分子克隆
        2.2.3 提取裂殖酵母基因組
        2.2.4 酵母轉化
        2.2.5 菌株凍存與活化
        2.2.6 篩選具有遺傳不穩(wěn)定性的突變菌株
        2.2.7 遺傳連鎖性分析(genetic linkage test)
        2.2.8 全基因組測序(whole genome sequencing)
        2.2.9 染色質免疫共沉淀(ChIP)
        2.2.10 轉錄組測序(RNA-seq)
        2.2.11 雙突變文庫的構建
        2.2.12 高溫(36℃)條件下檢測MTD突變發(fā)生回復的概率
        2.2.13 yox1-GFP表達的遺傳穩(wěn)定性探究
        2.2.14 二倍體菌株構建
        2.2.15 高深度全基因組測序
        2.2.16 超高深度定點二代測序
3.結果
    3.1 裂殖酵母中具有微型同源臂特征的短片段串聯(lián)重復介導的具有遺傳不穩(wěn)定性的表型
        3.1.1 ssp1 基因發(fā)生可逆的短片段串聯(lián)重復(MTD)突變介導不穩(wěn)定遺傳的雷帕霉素(+咖啡因)抗藥性
        3.1.2 Cnp1~(H100M)生長缺陷菌株進行生長抑制子(Suppressor)篩選中發(fā)現(xiàn)同種類型的MTD突變
    3.2 超深度定點測序及10,000X全基因組測序驗證細胞群體中亞克隆MTDS的存在及可能的調控元件
        3.2.1 超深度測序方法的運用及其檢測MTD的有效性
        3.2.2 運用超深度測序檢測單細胞起源的細胞群體中的亞克隆MTDs突變
        3.2.3 運用超深度測序及邏輯回歸模型驗證影響MTDs發(fā)生的順式-決定元件(cis-determinants)
    3.3 復制打滑(REPLICATION SLIPPAGE)模型對SSP1 位點短片段串聯(lián)重復(MTD)的回復起重要的調控作用
    3.4 自然分離菌株中,近一半的串聯(lián)重復和插入突變具有微型同源臂特征
4.結論與討論
    4.1 MTDS介導不穩(wěn)定遺傳的抗藥性及生長回復
    4.2 超深度測序檢測亞克隆MTDS
    4.3 介導MTDS的復制打滑模型(Replication Slippage)
5.參考文獻
個人簡歷



本文編號：3645751