本文關(guān)鍵詞：基因Ⅶ型NDV強(qiáng)毒株反向遺傳系統(tǒng)的建立及其應(yīng)用研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：新城疫(Newcastle Disease, ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)引起的禽類(lèi)的一種急性、高度接觸性傳染病。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)將其列為必須報(bào)告的傳染病,我國(guó)農(nóng)業(yè)部在動(dòng)物疫病病種目錄中將其列為一類(lèi)動(dòng)物疫病。疫苗免疫是防控該病的主要手段,但目前使用的疫苗株與流行株在同源性上存在一定差異,這使得一些免疫雞群仍然存在ND的爆發(fā)。我國(guó)NDV的流行株以基因VIM型為主。本實(shí)驗(yàn)室多年來(lái)一直從事NDV的流行病學(xué)調(diào)查工作,在各類(lèi)雞群中分離的NDV強(qiáng)毒均屬于基因Ⅶd型。這些毒株的主要免疫原性蛋白F和HN的同源性分別為96%～100%和93%～100%,相比之下這些毒株與疫苗株La Sota的F和HN蛋白的同源性僅為87.4%～88.8%和86.7%～88.8%。 NDV SG10株屬于基因Ⅶd型強(qiáng)毒株,是本實(shí)驗(yàn)室于2010年自爆發(fā)NDV的免疫雞群中分離獲得。前期的研究表明SG10具有較好的繁殖特性和免疫原性。其HN和F蛋白與其他基因Ⅶ型毒株的同源性分別在96.7%-99.7%和96.2%99.8%之間,與常用疫苗株La Sota的同源性分別為87.9%和88.3%。本研究首先構(gòu)建了SG10株的感染性克隆,通過(guò)對(duì)拯救病毒rSG10的生物學(xué)特性分析表明,重組病毒rSG10保留了與親本毒SGI0相似的生物學(xué)特性。隨后,我們通過(guò)該反向遺傳平臺(tái)對(duì)SG10株NP基因的5’非編碼區(qū)6nt進(jìn)行了缺失,構(gòu)建了突變株SG10-6bp。與原毒株SG10相比,突變株SG10-6bp的生物學(xué)特性和致病力均未發(fā)生明顯變化,表明NP基因的5’非編碼區(qū)的6nt并不影響NDV毒力。隨后,我們對(duì)SG10的F蛋白裂解位點(diǎn)處的氨基酸進(jìn)行了突變,使其在序列上與弱毒La Sota相同,構(gòu)建了突變株aSG10。與親本毒相比,aSG10的毒力明顯下降,其毒力與疫苗株LaSota相似,這表明F蛋白裂解位點(diǎn)是決定NDV毒力的主要因素。在此基礎(chǔ)上,我們將致弱毒aSG10改造成為了外源蛋白表達(dá)載體。我們選擇將外源基因插入在P與M之間,分別以綠色熒光蛋白和傳染性支氣管炎病毒(IBV)S1基因作為報(bào)告基因,構(gòu)建了重組病毒aSG10-EGFP和aSG10-S1,結(jié)果表明外源基因EGFP和S1蛋白均獲得了表達(dá),這說(shuō)明致弱株aSG10可以作為外源基因表達(dá)載體。 為了驗(yàn)證致弱株aSG10作為疫苗株的可行性,我們對(duì)aSG10進(jìn)行了1日齡雛雞免疫試驗(yàn),免疫雞在觀察期內(nèi)無(wú)明顯的臨床癥狀,同時(shí)剖檢觀察和病理組織學(xué)檢查也表明aSG10對(duì)雛雞的各個(gè)組織和器官均未造成明顯的損傷,這表明aSG10作為疫苗株具有良好的安全性。隨后,我們對(duì)免疫3周的動(dòng)物進(jìn)行了強(qiáng)毒株SG10的攻毒試驗(yàn),結(jié)果顯示aSG10株免疫組未出現(xiàn)明顯的臨床癥狀,病理剖檢觀察和病理組織學(xué)檢查也表明aSG10很好地保護(hù)了免疫動(dòng)物。對(duì)免疫后的排毒情況進(jìn)行檢測(cè)也表明,aSG10能更有效地阻止攻毒后的動(dòng)物向外界排毒。同時(shí),使用SG1O作為抗原進(jìn)行HI檢測(cè)表明,aSG10免疫組的HI抗體水平較La Sota免疫組高一個(gè)滴度,表明aSG10能刺激機(jī)體產(chǎn)生與強(qiáng)毒株SG10更匹配的免疫反應(yīng)。
【關(guān)鍵詞】：新城疫 反向遺傳 疫苗株
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：S852.65
【目錄】：

• 摘要3-4
• Abstract4-11
• 中英文對(duì)照表11-13
• 第一章 緒論13-27
• 1.1 新城疫病毒的概述13
• 1.2 新城疫病毒的分類(lèi)和理化特性13-14
• 1.3 新城疫病毒基因組的結(jié)構(gòu)14-15
• 1.4 NDV編碼的蛋白及其功能15-18
• 1.5 新城疫病毒的復(fù)制與致病性18-20
• 1.6 新城疫病毒的分子流行病學(xué)20-21
• 1.7 新城疫病毒疫苗學(xué)的概況21-22
• 1.8 新城疫病病毒的反向遺傳學(xué)及其應(yīng)用22-25
• 1.9 本研究的目的和意義25-27
• 第二章 NDV SG10株反向遺傳系統(tǒng)的建立27-46
• 2.1 引言27-28
• 2.2 材料和方法28-37
• 2.2.1 病毒和細(xì)胞28
• 2.2.2 質(zhì)粒和菌株28
• 2.2.3 SPF雞胚和SPF雞28
• 2.2.4 主要試劑和儀器28-29
• 2.2.5 病毒的純化29
• 2.2.6 病毒序列的測(cè)定29-31
• 2.2.7 輔助質(zhì)粒和微基因組的構(gòu)建31-33
• 2.2.8 輔助質(zhì)粒和微基因組的功能鑒定33
• 2.2.9 全長(zhǎng)cDNA克隆質(zhì)粒的構(gòu)建33-35
• 2.2.10 病毒的拯救35-36
• 2.2.11 拯救病毒的鑒定36
• 2.2.12 拯救病毒的致病性分析36
• 2.2.13 拯救病毒的生長(zhǎng)特性分析36-37
• 2.3 結(jié)果37-44
• 2.3.1 NDV SG10株序列的測(cè)定和分析37-40
• 2.3.2 輔助質(zhì)粒和微基因組的功能鑒定40-41
• 2.3.3 全長(zhǎng)cDNA克隆質(zhì)粒的構(gòu)建41-42
• 2.3.4 NDV SG10株的拯救與鑒定42-43
• 2.3.5 拯救病毒生物學(xué)特性的測(cè)定43
• 2.3.6 拯救病毒的生長(zhǎng)特性的分析43-44
• 2.4 討論44-45
• 2.5 小結(jié)45-46
• 第三章 應(yīng)用反向遺傳系統(tǒng)對(duì)NDV SG10株進(jìn)行改造46-63
• 3.1 引言46
• 3.2 材料和方法46-52
• 3.2.1 病毒、質(zhì)粒和細(xì)胞46-47
• 3.2.2 構(gòu)建SG10株NP基因5’端缺失6bp的突變株47-48
• 3.2.3 突變株rSG10-6bp的生物學(xué)特性分析48
• 3.2.4 構(gòu)建SG10株F蛋白裂解位點(diǎn)突變的病毒株48-49
• 3.2.5 突變株aSG10生物學(xué)特性分析49-50
• 3.2.6 表達(dá)綠色熒光蛋白的重組NDV的構(gòu)建50-51
• 3.2.7 突變株aSG10-EGFP生物學(xué)特性分析51
• 3.2.8 表達(dá)IBV S1蛋白重組NDV的構(gòu)建51-52
• 3.2.9 突變株aSG10-S1生物學(xué)特性分析52
• 3.3 結(jié)果52-60
• 3.3.1 SG10株NP基因5’端缺失6bp的突變株的構(gòu)建52-53
• 3.3.2 突變株rSG10-6bp生物學(xué)特性分析53-54
• 3.3.3 拯救病毒的生長(zhǎng)特性的測(cè)定54
• 3.3.4 構(gòu)建SG10株F蛋白裂解位點(diǎn)突變的病毒株54-55
• 3.3.5 突變株aSG10生物學(xué)特性分析55-56
• 3.3.6 拯救病毒的生長(zhǎng)特性的測(cè)定56
• 3.3.7 表達(dá)綠色熒光蛋白重組NDV的構(gòu)建56-57
• 3.3.8 突變株aSG10-EGFP生物學(xué)特性分析57-58
• 3.3.9 拯救病毒的生長(zhǎng)特性的測(cè)定58
• 3.3.10 表達(dá)IBV S1蛋白重組NDV的構(gòu)建58-59
• 3.3.11 突變株aSG10-S1生物學(xué)特性分析59-60
• 3.3.12 拯救病毒的生長(zhǎng)特性的測(cè)定60
• 3.4 討論60-61
• 3.5 小結(jié)61-63
• 第四章 重組病毒aSG10株的免疫原性評(píng)價(jià)63-76
• 4.1 引言63
• 4.2 材料和方法63-65
• 4.2.1 病毒、質(zhì)粒和細(xì)胞63-64
• 4.2.2 致弱株aSG10的安全性和免疫原性鑒定64-65
• 4.2.3 致弱株SG10的攻毒保護(hù)試驗(yàn)65
• 4.3 結(jié)果65-74
• 4.3.1 安全性檢測(cè)65-70
• 4.3.2 攻毒保護(hù)試驗(yàn)70-74
• 4.4 討論74-75
• 4.5 小結(jié)75-76
• 第五章 結(jié)論76-77
• 第六章 創(chuàng)新點(diǎn)77-78
• 參考文獻(xiàn)78-85
• 附錄85-95
• 致謝95-97
• 作者簡(jiǎn)介97

【參考文獻(xiàn)】

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  本文關(guān)鍵詞：基因Ⅶ型NDV強(qiáng)毒株反向遺傳系統(tǒng)的建立及其應(yīng)用研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：361249