乳酸菌是人和動物腸道內(nèi)重要的益生菌群,與人類生活密切相關(guān)。乳酸菌作為一種可安全使用的食品級微生物,其應(yīng)用歷史長久,且被廣泛地用于食品加工、工業(yè)發(fā)酵以及微生態(tài)制劑研制等多種領(lǐng)域,其中絕大多數(shù)種類的乳球菌和乳桿菌均可用于安全生產(chǎn)。乳酸菌具有提高人和動物胃腸道粘膜免疫功能的作用,可作為免疫佐劑,也是表達(dá)外源蛋白最理想的候選載體菌株。隨著對乳酸菌分子生物學(xué)研究的日益深入以及其在食品、醫(yī)藥等行業(yè)的廣泛應(yīng)用,可利用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)來構(gòu)建和應(yīng)用乳酸菌食品級高效表達(dá)載體系統(tǒng),這對于乳酸菌應(yīng)用潛能的開發(fā)和乳品工業(yè)的發(fā)展具有十分重要意義,也是近年來的研究熱點(diǎn)。乳酸乳球菌能夠廣泛的存在于人和動物消化道中,并發(fā)揮著重要的生理作用,而且其在作為安全性良好的外源基因表達(dá)宿主菌方面也已顯現(xiàn)出較大的發(fā)展?jié)摿�。乳酸菌整合載體主要用于染色體突變,即通過整合或基因替代進(jìn)行任意特殊位點(diǎn)基因的改變。食品級整合載體是在染色體上進(jìn)行基因重組,無選擇標(biāo)記、無堿基殘留,且重組多發(fā)生在非編碼區(qū)域。溫敏型質(zhì)粒在一定溫度范圍內(nèi)可正常復(fù)制,當(dāng)溫度高于一定閥值時(shí)質(zhì)粒復(fù)制效率降低或不復(fù)制。反選擇標(biāo)記基因指在特定的篩選條件下,含有反選擇標(biāo)記基因的... 

【文章來源】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)黑龍江省 211工程院校

【文章頁數(shù)】：95 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
英文摘要
1 前言
    1.1 研究的目的和意義
    1.2 乳酸菌的益生作用及其在基因工程中的應(yīng)用
        1.2.1 乳酸菌的益生性作用
        1.2.2 基因工程乳酸菌的應(yīng)用
        1.2.3 基因工程乳酸乳球菌的應(yīng)用
    1.3 乳酸菌食品級表達(dá)系統(tǒng)的研究進(jìn)展
        1.3.1 食品級選擇標(biāo)記研究進(jìn)展
        1.3.2 乳酸菌基因組整合系統(tǒng)的研究進(jìn)展
    1.4 基因工程（轉(zhuǎn)基因）乳酸菌的安全性評價(jià)
        1.4.1 基因工程（轉(zhuǎn)基因）乳酸菌安全性評價(jià)的必要性
        1.4.2 細(xì)菌轉(zhuǎn)錄組測序的研究進(jìn)展
2 材料與方法
    2.1 材料
        2.1.1 載體質(zhì)粒和菌株
        2.1.2 主要生物化學(xué)試劑
        2.1.3 引物合成與測序
        2.1.4 主要儀器設(shè)備
    2.2 試驗(yàn)方法
        2.2.1 乳球菌pGBWVHC32-upp載體的構(gòu)建
        2.2.2 pGBWVHC32-upp載體在L. lactis MG1363中的溫度敏感性試驗(yàn)
        2.2.3 基因打靶整合型載體的構(gòu)建
        2.2.4 缺失upp基因L. lactis MG1363的構(gòu)建
        2.2.5 缺失upp基因L. lactis MG1363的生物學(xué)特性分析
        2.2.6 Upp基因缺陷互補(bǔ)型質(zhì)粒載體系統(tǒng)的構(gòu)建
3 結(jié)果
    3.1 乳球菌pGBWVHC32-upp載體的構(gòu)建結(jié)果
        3.1.1 upp基因的擴(kuò)增和測序結(jié)果
        3.1.2 重組質(zhì)粒pMD18-T-upp的鑒定結(jié)果
        3.1.3 pGBWVHC32-upp載體的鑒定結(jié)果
    3.2 pGBWVHC32-upp載體在乳球菌中的溫度敏感性試驗(yàn)結(jié)果
    3.3 基因打靶整合型載體的構(gòu)建結(jié)果
        3.3.1 Upp基因兩側(cè)同源臂基因擴(kuò)增結(jié)果
        3.3.2 重組質(zhì)粒pMD18-T-1L/2L/1R/2R的鑒定結(jié)果
        3.3.3 pGBWVHC32-upp-1L載體的鑒定結(jié)果
        3.3.4 基因打靶整合型載體pGBWVHC32-upp-1L1R的鑒定結(jié)果
        3.3.5 基因打靶整合型載體pGBWVHC32-upp-1L2R的鑒定結(jié)果
        3.3.6 pGBWVHC32-upp-2L載體的鑒定結(jié)果
        3.3.7 基因打靶整合型載體pGBWVHC32-upp-2L1R的鑒定結(jié)果
        3.3.8 基因打靶整合型載體pGBWVHC32-upp-2L2R的鑒定結(jié)果
    3.4 缺失upp基因的L. lactis MG1363菌株的獲得
        3.4.1 缺失upp基因的L. lactis MG1363菌株的PCR鑒定結(jié)果
        3.4.2 缺失upp基因的L. lactis MG1363菌株中的質(zhì)粒殘留鑒定結(jié)果
        3.4.3 缺失upp基因的L. lactis MG1363菌株upp基因區(qū)域的測序結(jié)果
    3.5 缺失upp基因的L. lactis MG1363菌株的生物學(xué)特性分析結(jié)果
        3.5.1 缺失upp基因的L. lactis MG1363的遺傳穩(wěn)定性測試結(jié)果
        3.5.2 缺失upp基因的L. lactis MG1363和野生菌株生長曲線比較結(jié)果
        3.5.3 缺失upp基因的L. lactis MG1363和野生菌株碳源利用結(jié)果
        3.5.4 缺失upp基因的L. lactis MG1363和野生菌株的形態(tài)學(xué)比較結(jié)果
        3.5.5 缺失upp基因的L. lactis MG1363和野生菌株的轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果
    3.6 Upp基因缺陷互補(bǔ)型質(zhì)粒載體系統(tǒng)的構(gòu)建及CaIFN-γ 蛋白的表達(dá)
        3.6.1 Upp基因和pAMJ399-CaIFN-γ 的擴(kuò)增結(jié)果
        3.6.2 重組乳球菌pAMJ399upp-CaIFN-γ/△upp L. lactis MG1363的鑒定結(jié)果
        3.6.3 重組L. lactis MG1363表達(dá)CaIFN-γ 蛋白的鑒定
4 討論
    4.1 溫敏型質(zhì)粒和反選擇標(biāo)記在乳酸菌基因操作中的應(yīng)用
    4.2 乳酸乳球菌upp缺失菌株的生物學(xué)特性
    4.3 Upp基因缺陷互補(bǔ)型質(zhì)粒載體系統(tǒng)在L. lactis MG1363表達(dá)系統(tǒng)中的使用
5 結(jié)論
致謝
參考文獻(xiàn)
附錄
攻讀博士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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本文編號：3481734