本文關(guān)鍵詞：定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)熒光檢測(cè)技術(shù)研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Q-PCR, Quantitative Polymerase Chain Reaction)技術(shù)是基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET, Fluorescence Resonance Energy Transfer)的原理,在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán),利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR進(jìn)程中每個(gè)反應(yīng)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化,最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)起始模板數(shù)進(jìn)行定量分析的技術(shù)。為實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增模板的準(zhǔn)確定量,需要嚴(yán)格控制PCR試劑的反應(yīng)時(shí)間和反應(yīng)溫度；還需要對(duì)反應(yīng)過程中試劑發(fā)出的熒光信號(hào)進(jìn)行準(zhǔn)確的定量分析,包括能檢測(cè)到微安級(jí)微弱信號(hào)的光學(xué)系統(tǒng)和實(shí)現(xiàn)熒光數(shù)據(jù)定量描述的熒光信號(hào)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)。定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)系統(tǒng)包括實(shí)現(xiàn)目標(biāo)基因快速擴(kuò)增的熱循環(huán)系統(tǒng)和實(shí)現(xiàn)目標(biāo)基因準(zhǔn)確定量的熒光檢測(cè)系統(tǒng)。其中用于檢測(cè)熒光信號(hào)的光學(xué)系統(tǒng),是實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物定量檢測(cè)的核心元件�；趥鹘y(tǒng)的共聚焦式熒光檢測(cè)光路,本文提出了Y光纖型光學(xué)系統(tǒng)。該系統(tǒng)利用光纖的全反射原理,通過將激發(fā)光以全反射的形式引入Y光纖激發(fā)分支并激發(fā)熒光試劑發(fā)出熒光,再由光纖的發(fā)射分支接收熒光信號(hào)送至光電轉(zhuǎn)換器,由于沒有引入過多的傳統(tǒng)光學(xué)器件,因此大大降低了光線在傳輸過程中能量的損耗。通過光學(xué)軟件ZEMAX仿真對(duì)影響Y光纖型光學(xué)系統(tǒng)傳輸效率的影響因素進(jìn)行了分析,包括光源、透鏡參數(shù)、光纖數(shù)值孔徑和光纖損耗等；并結(jié)合實(shí)際熒光檢測(cè)實(shí)驗(yàn),對(duì)比基于共聚焦式和基于Y型光纖的熒光檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)結(jié)果,驗(yàn)證了Y光纖型光學(xué)系統(tǒng)的有效性。該光學(xué)系統(tǒng)對(duì)96孔樣品塊進(jìn)行掃描式檢測(cè),為避免光學(xué)系統(tǒng)與熱循環(huán)系統(tǒng)在結(jié)構(gòu)上的相互干涉,本文采用相互正交的雙螺桿電動(dòng)臺(tái)分別帶動(dòng)光學(xué)模塊和熱循環(huán)模塊作直線運(yùn)動(dòng)以完成熒光的激發(fā)和收集過程。由光學(xué)系統(tǒng)捕捉到的熒光數(shù)據(jù)非常微弱,一般處于微安量級(jí),并摻雜有噪聲信號(hào),因此在將模擬信號(hào)轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號(hào)之前需要對(duì)采集到的熒光數(shù)據(jù)進(jìn)行放大濾波處理,再通過數(shù)據(jù)采集卡對(duì)處理得到的模擬電壓信號(hào)進(jìn)行A/D轉(zhuǎn)換送至上位計(jì)算機(jī)的數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)。為完成擴(kuò)增模板的準(zhǔn)確定量,數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)需要對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)字濾波處理以進(jìn)一步去除信號(hào)中的噪聲干擾,并通過五點(diǎn)三次數(shù)據(jù)平滑處理提高曲線擬合效果,最后按照加載的定量算法求得目標(biāo)基因在各個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增量和起始拷貝數(shù)從而實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增片段的定量檢測(cè)。基于Liu Saint S型曲線模型,提出了改進(jìn)型定量算法,該算法考慮了聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)過程中每個(gè)循環(huán)擴(kuò)增效率的動(dòng)態(tài)性能,因此對(duì)熒光數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合分析更為科學(xué)客觀。通過使用本課題所研發(fā)的定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)系統(tǒng)進(jìn)行熒光檢測(cè)和基因定量實(shí)驗(yàn)可以得出,采用Y型光纖光學(xué)系統(tǒng)可以有效提高系統(tǒng)熒光檢測(cè)靈敏度,采用改進(jìn)型定量算法擬合熒光數(shù)據(jù)可有效提高定量結(jié)果的重復(fù)性和可靠性。
【關(guān)鍵詞】：定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) Y型光纖 耦合效率 熒光檢測(cè) 基因定量算法
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：Q503
【目錄】：

• 致謝5-6
• 摘要6-8
• Abstract8-12
• 第一章 緒論12-32
• 1.1 課題背景12-24
• 1.1.1 PCR技術(shù)簡(jiǎn)史12-13
• 1.1.2 PCR技術(shù)概論13-14
• 1.1.3 PCR技術(shù)基本原理14-16
• 1.1.4 熒光定量PCR技術(shù)簡(jiǎn)史16
• 1.1.5 熒光定量PCR技術(shù)概論16-21
• 1.1.6 熒光定量PCR數(shù)學(xué)原理21-24
• 1.2 熒光定量PCR系統(tǒng)及國(guó)內(nèi)外發(fā)展趨勢(shì)24-28
• 1.2.1 熒光定量PCR系統(tǒng)24-26
• 1.2.2 國(guó)內(nèi)外發(fā)展趨勢(shì)26-28
• 1.3 課題研究意義28-29
• 1.4 研究?jī)?nèi)容及章節(jié)安排29-32
• 第二章 熒光檢測(cè)光學(xué)系統(tǒng)設(shè)計(jì)與仿真分析32-56
• 2.1 熒光檢測(cè)光學(xué)系統(tǒng)設(shè)計(jì)32-48
• 2.1.1 光學(xué)系統(tǒng)設(shè)計(jì)34-43
• 2.1.2 光纖理論43-48
• 2.2 光學(xué)系統(tǒng)仿真分析48-56
• 2.2.1 光學(xué)系統(tǒng)搭建48-52
• 2.2.2 耦合效率影響因素分析52-54
• 2.2.3 光學(xué)系統(tǒng)性能研究54-56
• 第三章 熒光信號(hào)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)設(shè)計(jì)與實(shí)現(xiàn)56-72
• 3.1 放大與濾波電路設(shè)計(jì)56-64
• 3.1.1 I-V轉(zhuǎn)換前置放大電路設(shè)計(jì)57-59
• 3.1.2 二次放大電路設(shè)計(jì)59-60
• 3.1.3 濾波電路設(shè)計(jì)60-64
• 3.2 數(shù)字處理系統(tǒng)設(shè)計(jì)與實(shí)現(xiàn)64-69
• 3.2.1 運(yùn)動(dòng)控制子系統(tǒng)65-67
• 3.2.2 數(shù)字信號(hào)處理子系統(tǒng)67-69
• 3.3 熒光信號(hào)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)性能分析69-72
• 第四章 熒光定量算法設(shè)計(jì)72-96
• 4.1 熒光定量算法簡(jiǎn)介73-84
• 4.1.1 雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法75-76
• 4.1.2 2~(-△△ct)法76-79
• 4.1.3 Pfaffl算法79-80
• 4.1.4 S型曲線法80-84
• 4.2 改進(jìn)型定量算法84-91
• 4.3 改進(jìn)型定量算法性能研究91-96
• 第五章 系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)研究96-108
• 5.1 實(shí)驗(yàn)方案97-100
• 5.2 數(shù)據(jù)分析100-108
• 第六章 總結(jié)與展望108-112
• 6.1 論文總結(jié)108-110
• 6.2 課題展望110-112
• 參考文獻(xiàn)112-122
• 科研成果122

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 王宇華,李志華,段發(fā)階,葉聲華;光纖耦合效率與接收光強(qiáng)計(jì)算研究[J];光電工程;2005年07期

2 袁縱橫;胡放榮;;基于ZEMAX軟件設(shè)計(jì)的半導(dǎo)體激光無源光纖耦合系統(tǒng)[J];紅外與激光工程;2006年S5期

中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 黃靖;定量聚合酶鏈反應(yīng)熱循環(huán)系統(tǒng)及熒光檢測(cè)技術(shù)研究[D];浙江大學(xué);2012年

  本文關(guān)鍵詞：定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)熒光檢測(cè)技術(shù)研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：341978