本文關(guān)鍵詞：類受體激酶SOBIR1互作蛋白的鑒定及功能分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：植物通過位于細胞內(nèi)或者細胞表面上的免疫受體來識別病原體分子并激活免疫反應。位于膜上的免疫受體主要分為類受體蛋白和類受體激酶兩類,其中類受體激酶包括負責識別信號的胞外區(qū),跨膜區(qū)及激活下游信號的胞內(nèi)激酶區(qū)。與類受體激酶不同,類受體蛋白在胞內(nèi)區(qū)只含有短的多肽,無激酶結(jié)構(gòu)。番茄(Solanum lycopersicum)中抗葉霉菌(Cladosporium fulvum)蛋白Cfs為類受體蛋白,其如何傳導下游信號,機理還不清楚。最近,本實驗室發(fā)現(xiàn)類受體激酶SOBIR1可以與Cfs蛋白互作,沉默SOBIR1后減弱Cfs介導的過敏反應和抗病性,同時減少了Cf-4的積累和穩(wěn)定。本實驗室及其他研究者發(fā)現(xiàn)SOBIR1與大量的類受體蛋白結(jié)合,并且參與大量的類受體蛋白介導的下游信號。為了更好的了解類受體蛋白如何介導下游信號,以及SOBIR1在類受體蛋白復合體中的具體功能,本研究通過酵母雜交技術(shù)及免疫沉淀的方法鑒定SOBIR1的互作蛋白,構(gòu)建TVR載體沉默候選基因,驗證候選基因是否會對Cf-4/Avr4介導的過敏反應及抗性有影響。主要結(jié)果有:(1)通過對番茄Sl SOBIR1及擬南芥At SOBIR1結(jié)構(gòu)進行預測,發(fā)現(xiàn)SOBIR1蛋白含有5個亮氨酸重復序列,1個跨膜區(qū)及胞內(nèi)激酶區(qū)。通過比對SOBIR1同源蛋白序列發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)激酶區(qū)較胞外區(qū)保守,發(fā)現(xiàn)跨膜區(qū)Wxx Gxxx Gxxx G基序在多個SOBIR1同源蛋白中保守存在。(2)構(gòu)建PGBKT7-Sl SOBIR1-Kinase載體,通過western blot實驗證明SOBIR1激酶結(jié)構(gòu)可以在酵母中表達。自激活實驗及毒性檢測證明SOBIR1激酶結(jié)構(gòu)對酵母無自激活及無毒性。利用SOBIR1激酶結(jié)構(gòu)對番茄cDNA文庫進行酵母雜交篩庫,發(fā)現(xiàn)基因VDAC及SAP18可能為SOBIR1互作蛋白的候選蛋白。(3)構(gòu)建TRV-VDAC及TRV-SAP18載體分別沉默本式煙中VDAC及SAP18同源基因,發(fā)現(xiàn)沉默SAP18減弱了Cf-4/Avr4介導的過敏反應,而沉默VDAC對Cf-4/Avr4介導的過敏反應沒有影響。進一步沉默番茄中SAP18同源基因,減弱了Cf-4介導的對葉霉病的抗性。在本式煙中共同表達VDAC及SOBIR1,免疫共沉淀實驗發(fā)現(xiàn)VDAC不能與SOBIR1共同純化出來。(4)對番茄轉(zhuǎn)化載體35S:SOBIR1-e GFP或35S:FLS2-GFP,并通過PCR及western blot確認獲得轉(zhuǎn)基因番茄。比較轉(zhuǎn)基因番茄表達SOBIR1-e GFP及轉(zhuǎn)基因番茄超表達FLS2-GFP,發(fā)現(xiàn)SOBIR1轉(zhuǎn)基因植株獲得率低,且SOBIR1表達量低,超表達SOBIR1番茄表現(xiàn)植株矮小。(5)純化Avr4蛋白,并通過稀釋不同濃度梯度1000μg/ml、200μg/ml、100μg/ml、50μg/ml、20μg/ml及1μg/ml,發(fā)現(xiàn)濃度大于100μg/ml時能誘導番茄Moneymaker-Cf-4過敏反應。在轉(zhuǎn)基因本式煙Cf-4中注射Avr4濃度為1000μg/ml,同樣能誘導Cf-4介導的過敏反應,說明可以激活下游信號。(6)轉(zhuǎn)基因番茄穩(wěn)定表達SOBIR1-eGFP和擬南芥中穩(wěn)定表達SOBIR1-YFP,并利用GFP affinity beads純化SOBIR1。通過在煙草中瞬時表達SOBIR1-GFP,并利用Avr4蛋白進行處理,同時以水處理作為對照,利用GFP affinity beads純化煙草葉片中總蛋白的SOBIR1-GFP。在煙草中瞬時表達SOBIR1激酶結(jié)構(gòu)或者無激酶活性的SOBIR1激酶結(jié)構(gòu),利用GFP affinity beads純化煙草葉片中總蛋白SOBIR1激酶結(jié)構(gòu)-GFP。通過質(zhì)譜對共沉淀的蛋白進行測序,最后選擇了DRP2、PP2C、GB及STK作為候選基因。(7)構(gòu)建不同TRV載體分別沉默本式煙中DRP2、PP2C、GB及STK同源基因,發(fā)現(xiàn)沉默STK減弱了Cf-4/Avr4介導的過敏反應,而沉默DRP2、PP2C及GB對Cf-4/Avr4介導的過敏反應沒有影響。
【關(guān)鍵詞】：番茄 類受體蛋白 類受體激酶 植物免疫 抗病信號 SOBIR1
【學位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：Q943.2
【目錄】：

• 摘要8-10
• Abstract10-12
• 1 前言12-26
• 1.1 研究目的意義、研究內(nèi)容、實驗設(shè)計12-14
• 1.1.1 本研究的目的意義12-13
• 1.1.2 研究內(nèi)容13
• 1.1.3 試驗設(shè)計13-14
• 1.2 文獻綜述14-26
• 1.2.1 番茄抗葉霉病的研究進展14-18
• 1.2.2 膜受體蛋白研究進展18-21
• 1.2.3 SOBIR1研究進展21-22
• 1.2.4 互作蛋白鑒定方法的研究進展22-26
• 2 材料與方法26-42
• 2.1 實驗材料26
• 2.1.1 植物材料26
• 2.1.2 菌株和質(zhì)粒26
• 2.2 方法26-36
• 2.2.1 植物的無菌培養(yǎng)與栽培26-27
• 2.2.2 載體構(gòu)建的一般方法27-30
• 2.2.3 各種植物表達載體的構(gòu)建30-31
• 2.2.4 酵母雜交篩選c DNA文庫31-33
• 2.2.5 轉(zhuǎn)基因植物獲得33-34
• 2.2.6 植物總蛋白的提取及免疫印跡共沉淀34-35
• 2.2.7 質(zhì)譜樣品制備35
• 2.2.8 總RNA的提取35-36
• 2.2.9 HR檢測和Cladosporium fulvum接種測定36
• 2.3 試劑及緩沖液配方36-42
• 2.3.1 常用分子生物學試劑配方36-38
• 2.3.2 常用緩沖液配方38-39
• 2.3.3 常用培養(yǎng)基配方39-42
• 3 結(jié)果與分析42-75
• 3.1 SOBIR1蛋白序列分析42-44
• 3.1.1 SOBIR1蛋白進化樹分析42
• 3.1.2 SOBIR1蛋白結(jié)構(gòu)域分析42-43
• 3.1.3 SOBIR1同源蛋白跨膜區(qū)分析43-44
• 3.2 通過酵母雜交技術(shù)鑒定Sl SOBIR1互作蛋白44-50
• 3.2.1 酵母能穩(wěn)定表達Sl SOBIR1-kinase domain(KD)和Sl SOBIR1-RD/ N-kinase domain44-45
• 3.2.2 自激活檢測45-46
• 3.2.3 毒性檢測46-47
• 3.2.4 酵母雜交效率檢測47
• 3.2.5 PCR及酶切篩選重復序列47
• 3.2.6 測序結(jié)果47-49
• 3.2.7 酵母共轉(zhuǎn)化49-50
• 3.2.8 候選基因功能預測50
• 3.3 酵母雜交候選基因功能驗證50-53
• 3.3.1 VDAC功能驗證50-52
• 3.3.2 SAP18功能驗證52-53
• 3.4 通過質(zhì)譜技術(shù)鑒定SlSOBIR1互作蛋白53-70
• 3.4.1 植物材料準備53-58
• 3.4.2 質(zhì)譜樣品準備58-62
• 3.4.3 質(zhì)譜結(jié)果與分析62-68
• 3.4.4 候選基因生物信息學分析68-70
• 3.5 質(zhì)譜候選基因功能驗證70-75
• 3.5.1 候選基因表達量分析70-71
• 3.5.2 功能驗證71-75
• 4 討論75-81
• 4.1 SOBIR1進化保守75-76
• 4.2 酵母雜交及免疫沉淀假陽性76-77
• 4.3 SOBIR1自激活77-78
• 4.4 SOBIR1下游途徑78
• 4.5 假陽性基因功能討論78-79
• 4.6 主要創(chuàng)新點79
• 4.7 今后研究的方向與目標79-81
• 5 結(jié)論81-82
• 致謝82-83
• 參考文獻83-94
• 攻讀博士學位期間發(fā)表的學術(shù)論文94

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  本文關(guān)鍵詞：類受體激酶SOBIR1互作蛋白的鑒定及功能分析，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：335016