本文關(guān)鍵詞：抗CD20片段抗體在擬南芥種子中的表達(dá)及其所引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激響應(yīng)，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：分子農(nóng)業(yè)（molecular farming）是指在植物中生產(chǎn)包括藥用蛋白和工業(yè)蛋白在內(nèi)的重組蛋白以及其他的次生代謝產(chǎn)物。目前已有多種哺乳動物來源的復(fù)雜蛋白在植物中獲得了表達(dá)，如人血清蛋白、生長激素、抗體、疫苗、細(xì)胞因子等。 在植物生物反應(yīng)器的各種表達(dá)手段中，利用種子表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)重組蛋白具有很多的優(yōu)點(diǎn)。作為一種天然的儲藏器官，種子提供了一個(gè)穩(wěn)定的環(huán)境，適于重組蛋白的長期存儲，并且有利于重組蛋白的運(yùn)輸。盡管經(jīng)過多年的不斷發(fā)展植物生物反應(yīng)器已經(jīng)獲得了巨大進(jìn)步，但是對于不同亞細(xì)胞位置定向表達(dá)重組蛋白對宿主細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)質(zhì)量控制系統(tǒng)的影響卻知之甚少。 本研究中我們在野生型擬南芥Col-0和糖基化突變體TKO的種子中對抗CD20片段抗體進(jìn)行了表達(dá)。首先我們通過PCR的技術(shù)分別將南芥2S2信號肽、大麥Amylase信號肽、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號SEKDEL與片段抗體的編碼序列融合，構(gòu)建了4套不同調(diào)控序列的植物表達(dá)載體，通過Floral Dip法對擬南芥進(jìn)行了轉(zhuǎn)化，經(jīng)平皿篩選后共獲得181株不同遺傳背景和調(diào)控序列的轉(zhuǎn)基因株系。通過Elisa、SDS-PAGE和Western Blot對轉(zhuǎn)基因株系中重組蛋白的表達(dá)進(jìn)行了鑒定。最高的表達(dá)量是通過融合擬南芥2S2種子儲藏蛋白信號肽獲得的，可達(dá)到總可溶性蛋白的6.12%。 通過Endo H和PNGase F處理，我們對純化后的幾種不同N-糖基結(jié)構(gòu)的重組蛋白進(jìn)行了N-糖基結(jié)構(gòu)分析。WTC2B8SEKDEL的N-糖基結(jié)構(gòu)成高甘露糖型，TKO背景scFv-Fc不存在巖藻糖及木質(zhì)糖的修飾，WTC2B82S2的N-糖基結(jié)構(gòu)部分以高甘露糖形式存在，但絕大部分為復(fù)雜型。通過抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性（ADCC）和補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒性（CDC）實(shí)驗(yàn)對重組蛋白的抗腫瘤活性進(jìn)行了鑒定，，結(jié)果表明不含有巖藻糖修飾的片段抗體具有更強(qiáng)的ADCC能力，而植物源scFv-Fc的CDC能力較Rituximab有所減弱。 最后，在種子發(fā)育至13dpa（day post anthesis）時(shí)，我們通過qRT-PCR的方法對正常生長條件下和熱激后宿主細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)進(jìn)行了分析。基于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激感應(yīng)因子表達(dá)的變化，我們的結(jié)果表明在擬南芥種子中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定向表達(dá)重組蛋白對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的穩(wěn)態(tài)施加了更大的壓力，并且讓其更易受到其他應(yīng)激因素的脅迫。 qRT-PCR的結(jié)果同樣也表明重組蛋白的表達(dá)不僅上調(diào)了宿主細(xì)胞中ERAD（ER-associated degradation）相關(guān)基因的表達(dá)，并使其質(zhì)量控制系統(tǒng)變得更為復(fù)雜。而宿主的質(zhì)量控制系統(tǒng)不僅影響著內(nèi)源蛋白的合成、修飾和分泌，同時(shí)也對重組蛋白的終產(chǎn)量有著巨大的影響，因此研究不同亞細(xì)胞位置定向表達(dá)對宿主內(nèi)穩(wěn)態(tài)的影響可以為制定最佳表達(dá)策略提供思路，特別是考慮到在商業(yè)化種植過程中一些環(huán)境因素同樣可以造成宿主的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。
【關(guān)鍵詞】：植物生物反應(yīng)器 擬南芥種子 抗CD20片段抗體 細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性 補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒性 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激響應(yīng) 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)關(guān)聯(lián)的蛋白降解
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：Q943.2
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-13
• 第1章 文獻(xiàn)綜述13-41
• 1.1 植物源重組蛋白的概況13-24
• 1.1.1 單克隆抗體16-21
• 1.1.2 疫苗21-24
• 1.2 對重組蛋白表達(dá)量的優(yōu)化24-29
• 1.2.1 轉(zhuǎn)錄、mRNA 穩(wěn)定性和翻譯的調(diào)控25-26
• 1.2.2 位置效應(yīng)26-28
• 1.2.3 重組蛋白穩(wěn)定性28
• 1.2.4 環(huán)境因素28-29
• 1.3 重組糖蛋白的糖基化修飾29-34
• 1.3.1 去除植物特異的糖基化修飾30-31
• 1.3.2 引入哺乳動物糖基轉(zhuǎn)移酶及糖基供體31
• 1.3.3 調(diào)整糖基轉(zhuǎn)移酶在細(xì)胞器中的位置31-32
• 1.3.4 通過瞬時(shí)表達(dá)重建修飾通路32-34
• 1.4 糖蛋白的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)關(guān)聯(lián)降解34-38
• 1.4.1 哺乳動物細(xì)胞和酵母中的 ERAD35-36
• 1.4.2 植物中的 ERAD36-38
• 1.5 植物生物反應(yīng)器的發(fā)展前景38-41
• 第2章 抗 CD20 scFv-Fc 植物種子特異性表達(dá)載體的構(gòu)建41-59
• 2.1 序言41-43
• 2.2 實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)備43-44
• 2.2.1 實(shí)驗(yàn)材料43
• 2.2.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備43-44
• 2.3 實(shí)驗(yàn)方法44-51
• 2.3.1 2S2 和 Amy 信號肽編碼序列、Ale-scFv-Fc 的基因序列合成44-46
• 2.3.2 引物設(shè)計(jì)46-47
• 2.3.3 2S2-scFv 和 Amy-scFv 的融合 PCR47-48
• 2.3.4 融合片段與 T1 載體的連接48
• 2.3.5 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞 DH5α的制備48-49
• 2.3.6 重組質(zhì)粒 T1-2S2-scFv 和 T1-Amy-scFv 的轉(zhuǎn)化和篩選49
• 2.3.7 重組質(zhì)粒 T1-2S2-scFv-FcSEKDEL 的獲得49-50
• 2.3.8 重組質(zhì)粒 pPhasBar-2S2-scFv-Fc、pPhasBar-Amy-scFv-Fc、pPhasBar-Ale-scFv-Fc、pPhasBar-2S2-scFv-FcSEKDEL 的獲得50-51
• 2.4 結(jié)果與分析51-56
• 2.4.1 重組質(zhì)粒 T1-2S2-scFv-Fc 和 T1-Amy-scFv-Fc 的構(gòu)建51-52
• 2.4.2 重組質(zhì)粒 T1-2S2-scFv-FcSEKDEL 的構(gòu)建52
• 2.4.3 重組質(zhì)粒 pPhasBar-2S2-scFv-Fc、pPhasBar--Amy-scFv-Fc、pPhasBar-Ale-scFv-Fc、pPhasBar-2S2-scFv-FcSEKDEL 的構(gòu)建52-56
• 2.5 討論56-57
• 2.6 小結(jié)57-59
• 第3章 抗 CD20 scFv-Fc 的表達(dá)、純化及抗腫瘤活性研究59-83
• 3.1 序言59
• 3.2 實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)備59-62
• 3.2.1 實(shí)驗(yàn)材料59-61
• 3.2.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備61-62
• 3.3 實(shí)驗(yàn)方法62-69
• 3.3.1 農(nóng)桿菌感受態(tài)的制備及凍融法轉(zhuǎn)化62
• 3.3.2 擬南芥的種植及浸染法轉(zhuǎn)化62-63
• 3.3.3 轉(zhuǎn)基因擬南芥的篩選63-64
• 3.3.4 轉(zhuǎn)基因擬南芥的 SDS-PAGE 及 Western Blot 檢測64
• 3.3.5 重組蛋白表達(dá)量的夾心法 ELISA 及 BCA 檢測64-65
• 3.3.6 重組蛋白的純化65-66
• 3.3.7 重組蛋白的 N-糖基化分析66-67
• 3.3.8 細(xì)胞培養(yǎng)基本操作67
• 3.3.9 重組蛋白的 ADCC 能力鑒定67-68
• 3.3.10 重組蛋白的 CDC 能力鑒定68-69
• 3.4 結(jié)果與分析69-79
• 3.4.1 轉(zhuǎn)基因株系的獲得69-72
• 3.4.2 重組蛋白的表達(dá)鑒定72-75
• 3.4.3 重組蛋白的純化及 N-糖基結(jié)構(gòu)研究75-77
• 3.4.4 重組蛋白的 ADCC 和 CDC 活性研究77-79
• 3.5 討論79-81
• 3.6 小結(jié)81-83
• 第4章 抗 CD20 scFv-Fc 在擬南芥種子中所引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激響應(yīng)83-97
• 4.1 序言83-84
• 4.2 實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)備84-85
• 4.2.1 實(shí)驗(yàn)材料84
• 4.2.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備84-85
• 4.3 實(shí)驗(yàn)方法85-88
• 4.3.1 植株的培養(yǎng)及處理85
• 4.3.2 總 RNA 的提取及檢測85
• 4.3.3 總 RNA 樣本的處理及 cDNA 第一鏈的合成85-87
• 4.3.4 引物設(shè)計(jì)及 qRT-PCR87-88
• 4.4 結(jié)果與分析88-92
• 4.4.1 總 RNA 的提取88-90
• 4.4.2 不同轉(zhuǎn)基因株系中 QC 相關(guān)基因的表達(dá)分析90-92
• 4.5 討論92-95
• 4.6 小結(jié)95-97
• 參考文獻(xiàn)97-113
• 附錄一 溶液及抗生素配方113-117
• 附錄二 測序結(jié)果117-121
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文及取得的科研成果121-123
• 致謝123

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 黃雪清;衛(wèi)志明;;影響農(nóng)桿菌介導(dǎo)玉米優(yōu)良自交系遺傳轉(zhuǎn)化的因素[J];實(shí)驗(yàn)生物學(xué)報(bào);2004年05期

  本文關(guān)鍵詞：抗CD20片段抗體在擬南芥種子中的表達(dá)及其所引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激響應(yīng)，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：330655