本文關(guān)鍵詞：若干酶反應(yīng)抑制劑的研制及檢測(cè)新方法的構(gòu)建，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：酶(enzyme)是一種生物催化劑,高效地催化多種生物化學(xué)反應(yīng),而且,機(jī)體新陳代謝所包括的所有化學(xué)反應(yīng)幾乎都受酶的催化,只有相應(yīng)酶存在時(shí),人體內(nèi)才能進(jìn)行對(duì)應(yīng)的生命活動(dòng)。另一方面,有機(jī)體的生命活動(dòng)表現(xiàn)了它內(nèi)部化學(xué)反應(yīng)歷程的有序性,這種有序性是受多方面因素控制的,一旦破壞了這種有序性,就會(huì)導(dǎo)致代謝紊亂,產(chǎn)生疾病,甚至死亡。大量的研究表明,人體許多疾病的發(fā)生與人體內(nèi)某些酶的活性高低有關(guān),酶反應(yīng)的調(diào)節(jié)能夠改善和治療疾病,而許多活性物質(zhì)正是通過抑制酶反應(yīng)來發(fā)揮作用。因此,研制新型酶反應(yīng)抑制劑、構(gòu)建抑制劑檢測(cè)的新方法,具有非常重要的意義。基于此,本論文研制了抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶水解反應(yīng)的活性物質(zhì),即淀粉-果膠復(fù)合物、淀粉-膳食纖維復(fù)合物和木質(zhì)素,并建立了檢測(cè)二肽基肽酶IV和醌氧化還原酶抑制劑的電化學(xué)檢測(cè)方法。本論文的主要研究?jī)?nèi)容如下:1.淀粉-果膠復(fù)合物對(duì)α-淀粉酶水解反應(yīng)抑制作用的研究作為糖尿病藥物靶點(diǎn)酶,α-淀粉酶水解反應(yīng)的抑制能夠減輕糖尿病癥狀,促進(jìn)人體健康。在論文本部分中,我們利用三偏磷酸鈉為交聯(lián)劑,將淀粉與果膠進(jìn)行交聯(lián),研制了一種新型化學(xué)修飾的抗性淀粉,即淀粉-果膠復(fù)合物,這種復(fù)合物能夠抵抗α-淀粉酶的催化水解。研究表明,在該復(fù)合物中,淀粉部分的晶體類型沒有發(fā)生變化,但其結(jié)晶度增加,此外,復(fù)合物的熱穩(wěn)定性以及結(jié)構(gòu)均質(zhì)性與結(jié)晶區(qū)的雙螺旋序列正相關(guān)。因此,在論文此部分,我們不僅研制了一種新型的能夠抑制α-淀粉酶水解的淀粉-果膠復(fù)合物,而且提出了制備抑制劑復(fù)合物的新方法。2.淀粉-可溶性膳食纖維復(fù)合物對(duì)α-淀粉酶水解反應(yīng)抑制作用的研究在論文這一部分,我們分別使用傳統(tǒng)濕熱法(CHMT)和微波濕熱法(MHMT)兩種處理方法,將淀粉與可溶性膳食纖維(SDF)交聯(lián)起來,制備得到了抗性淀粉-SDF復(fù)合物。研究表明,經(jīng)CHMT法得到的淀粉-SDF復(fù)合物幾乎完全抑制了α-淀粉酶的水解,但由MHMT法制得的復(fù)合物抑制效果不明顯。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),在CHMT中,SDF與位于無定型區(qū)葡萄糖分子2、3或6-OH相連接,結(jié)合至整個(gè)淀粉顆粒的外表層,這種結(jié)合使得整個(gè)淀粉顆粒難于被酶水解。然而,在MHMT中,SDF與破損了的淀粉顆粒的無定型區(qū)結(jié)合,使得制備得到的復(fù)合物具有較高的均質(zhì)性,導(dǎo)致了其難于抑制水解酶的水解。因此,在論文此部分,我們不僅成功制備得到了能夠幾乎完全抑制α-淀粉酶水解的淀粉-SDF復(fù)合物,而且初步揭示了α-淀粉酶被抑制的機(jī)理。3.木質(zhì)素對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制作用的研究作為治療糖尿病的靶點(diǎn)酶,α-葡萄糖苷酶的抑制劑發(fā)現(xiàn)具有重要的臨床意義。我們?cè)谡撐谋静糠种械难芯堪l(fā)現(xiàn),木質(zhì)素是α-葡萄糖苷酶的有效抑制劑,其半數(shù)抑制濃度為0.076μM,遠(yuǎn)低于市售糖尿病藥物阿卡波糖的半數(shù)抑制濃度(0.66 m M)。進(jìn)一步研究表明,木質(zhì)素能夠競(jìng)爭(zhēng)性地抑制α-葡萄糖苷酶活性,Ki值為0.3×10-5 M,同時(shí),木質(zhì)素能與α-葡萄糖苷酶作用形成1:1的復(fù)合物,在293 K時(shí)的結(jié)合常數(shù)為1.39×106 M-1,兩者間的主要結(jié)合力是疏水作用和氫鍵,結(jié)合距離為3.54 nm。此外,研究發(fā)現(xiàn),木質(zhì)素-α-葡萄糖苷酶復(fù)合物的形成改變了α-葡萄糖苷酶的α-螺旋結(jié)構(gòu)和芳香族氨基酸側(cè)鏈的構(gòu)象,增加了蛋白顆粒的體積,木質(zhì)素與α-葡萄糖苷酶的結(jié)合符合一級(jí)指數(shù)衰減函數(shù)。因此,論文此部分工作不僅發(fā)現(xiàn)了一種新的抑制劑,而且為開發(fā)木質(zhì)素作為糖尿病治療的活性物質(zhì)提供了科學(xué)依據(jù)。4.二肽基肽酶IV抑制劑電化學(xué)檢測(cè)方法的構(gòu)建針對(duì)當(dāng)前糖尿病藥物治療的靶點(diǎn)酶即二肽基肽酶IV(DPP-IV)抑制劑篩選方法的缺陷,我們提出了一種該酶活性檢測(cè)及其抑制劑篩選的電化學(xué)方法。在該方法中,我們將酶的底物Fc-多肽連接于金納米顆粒表面,并利用苯環(huán)層和金納米顆粒對(duì)信號(hào)進(jìn)行雙重放大,使得DPP-IV的最低檢測(cè)濃度為39 n U/m L,線性檢測(cè)范圍為0.5μU/m L至2.5 m U/m L。同時(shí),利用這一新方法,我們還評(píng)價(jià)了抑二肽素A和His-Leu雙肽對(duì)DPP-IV活性的抑制作用,測(cè)定得到二者的半數(shù)抑制濃度分別為93.5μM和95.5μM。此外,該方法快速、準(zhǔn)確、選擇性好,可用于其他多肽酶以及蛋白酶的活性檢測(cè)與抑制劑篩選。5.醌氧化還原酶抑制劑電化學(xué)檢測(cè)方法的構(gòu)建NAD(P)H依賴的醌類氧化還原酶1(NQO1)是一種廣泛分布的黃素蛋白,它以NADH或者NADPH為輔助因子,通過兩電子的還原作用將醌類物質(zhì)還原為相應(yīng)的還原型醌。已有的研究發(fā)現(xiàn),NQO1在人多種腫瘤中的表達(dá)均較高,因此NQO1成為抗腫瘤藥物的潛在靶點(diǎn)。在論文本部分,我們利用NQO1底物,即醌類衍生物的電化學(xué)活性,通過巰基乙胺將該底物共價(jià)連接至電極表面,構(gòu)建了一種檢測(cè)NQO1酶活性的電化學(xué)方法。在優(yōu)化的條件下,NQO1酶活性的檢測(cè)范圍為0.1至10 U/m L,檢測(cè)限為0.22 U/m L。隨后,我們利用所構(gòu)建的電化學(xué)方法研究了白藜蘆醇對(duì)NQO1的抑制作用,得到白藜蘆醇對(duì)NQO1的最大抑制率為95%,半數(shù)抑制濃度為23.70μM。
【關(guān)鍵詞】：酶 抑制劑 生化分析 生物傳感 電化學(xué)分析 淀粉-果膠復(fù)合物 淀粉-可溶性膳食纖維復(fù)合物 木質(zhì)素 α-淀粉酶 α-葡萄糖苷酶 二肽基肽酶IV 醌類氧化還原酶1
【學(xué)位授予單位】：上海大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：Q55
【目錄】：

• 摘要6-9
• ABSTRACT9-18
• 第一章 緒論18-50
• 1.1 酶及其反應(yīng)抑制劑18-29
• 1.1.1 α-淀粉酶及其反應(yīng)抑制劑18-21
• 1.1.2 α-葡萄糖苷酶及其反應(yīng)抑制劑21-24
• 1.1.3 二肽基肽酶Ⅳ及其反應(yīng)抑制劑24-27
• 1.1.4 醌氧化還原酶1及其反應(yīng)抑制劑27-29
• 1.2 酶反應(yīng)抑制劑的研究方法29-41
• 1.2.1 紫外光譜法29-30
• 1.2.2 熒光光譜法30-32
• 1.2.3 傅里葉變換紅外光譜法32-33
• 1.2.4 圓二色譜法33-34
• 1.2.5 共振光散射法34-35
• 1.2.6 電化學(xué)方法35-41
• 1.3 本論文的主要研究?jī)?nèi)容41
• 1.4 參考文獻(xiàn)41-50
• 第二章 淀粉-果膠復(fù)合物對(duì) α-淀粉酶水解反應(yīng)抑制作用的研究50-64
• 2.1 引言50-51
• 2.2 材料與方法51-54
• 2.2.1 試劑和儀器51-52
• 2.2.2 樣品制備52
• 2.2.3 對(duì) α-淀粉酶水解作用的影響52-53
• 2.2.4 X-射線衍射53
• 2.2.5 傅里葉變換紅外光譜53
• 2.2.6 熱力學(xué)分析53
• 2.2.7 抗性淀粉（RS）含量53-54
• 2.2.8 統(tǒng)計(jì)分析54
• 2.3 結(jié)果與討論54-62
• 2.3.1 對(duì)酶水解作用的抵抗54-56
• 2.3.2 晶體特征56-57
• 2.3.3 熱力學(xué)特性57-61
• 2.3.4 抗性淀粉含量61-62
• 2.4 結(jié)論62
• 2.5 參考文獻(xiàn)62-64
• 第三章 淀粉-可溶性膳食纖維復(fù)合物對(duì) α-淀粉酶水解反應(yīng)抑制作用的研究64-81
• 3.1 引言64-65
• 3.2 材料與方法65-68
• 3.2.1 樣品與試劑65-66
• 3.2.2 淀粉-SDF復(fù)合物制備66
• 3.2.3 對(duì)酶水解作用的影響66-67
• 3.2.4 X-射線衍射67
• 3.2.5 傅里葉變換紅外光譜67
• 3.2.6 熱力學(xué)分析67-68
• 3.2.7 統(tǒng)計(jì)分析68
• 3.3 結(jié)果與討論68-78
• 3.3.1 對(duì)酶水解作用的抵抗68-69
• 3.3.2 結(jié)構(gòu)特性69-73
• 3.3.3 熱力學(xué)特性73-78
• 3.3.4 抗性淀粉-可溶性膳食纖維復(fù)合物形成機(jī)制78
• 3.4 結(jié)論78-79
• 3.5 參考文獻(xiàn)79-81
• 第四章 木質(zhì)素對(duì) α-葡萄糖苷酶抑制作用的研究81-103
• 4.1 引言81
• 4.2 材料與方法81-85
• 4.2.1 材料與試劑81-82
• 4.2.2 木質(zhì)素對(duì) α-葡萄糖苷酶的抑制作用82-83
• 4.2.3 熒光光譜83-84
• 4.2.4 圓二色光譜84
• 4.2.5 原子力顯微鏡84-85
• 4.2.6 統(tǒng)計(jì)分析85
• 4.3 結(jié)果與討論85-100
• 4.3.1 木質(zhì)素對(duì) α-葡萄糖苷酶的抑制作用85-88
• 4.3.2 木質(zhì)素與 α-葡萄糖苷酶的交互作用88-94
• 4.3.3 α-葡萄糖苷酶-木質(zhì)素相互作用對(duì) α-葡萄糖苷酶構(gòu)象的影響94-97
• 4.3.4 木質(zhì)素作用前后 α-葡萄糖苷酶的粒狀特性97-99
• 4.3.5 α-葡萄糖苷酶與木質(zhì)素相互作用的動(dòng)力學(xué)研究99-100
• 4.4 結(jié)論100
• 4.5 參考文獻(xiàn)100-103
• 第五章 二肽基肽酶IV抑制劑電化學(xué)檢測(cè)方法的構(gòu)建103-120
• 5.1 引言103-104
• 5.2 實(shí)驗(yàn)材料與方法104-107
• 5.2.1 材料與試劑104-106
• 5.2.2 巰基乙胺功能化的金納米顆粒（CA-Au NPs）的合成106
• 5.2.3 電極表面的處理與修飾106-107
• 5.2.4 電極表面Fc-多肽的水解反應(yīng)107
• 5.2.5 DPP-IV活性的抑制107
• 5.2.6 電化學(xué)檢測(cè)107
• 5.3 結(jié)果與討論107-117
• 5.3.1 金電極表面的電化學(xué)表征110-112
• 5.3.2 電極修飾及酶反應(yīng)條件的優(yōu)化112-114
• 5.3.3 DPP-IV活性的電化學(xué)檢測(cè)114-115
• 5.3.4 抑制劑檢測(cè)115-117
• 5.4 結(jié)論117
• 5.5 參考文獻(xiàn)117-120
• 第六章 醌氧化還原酶抑制劑電化學(xué)檢測(cè)方法的構(gòu)建120-134
• 6.1 引言120-121
• 6.2 實(shí)驗(yàn)材料與方法121-124
• 6.2.1 材料與試劑121-123
• 6.2.2 金電極的修飾123
• 6.2.3 NQO1的還原作用123
• 6.2.4 白藜蘆醇的抑制作用123-124
• 6.2.5 電化學(xué)檢測(cè)124
• 6.3 結(jié)果與討論124-130
• 6.3.1 修飾電極的電化學(xué)表征125-127
• 6.3.2 NQO1酶活性的電化學(xué)檢測(cè)127-129
• 6.3.3 白藜蘆醇的抑制作用129-130
• 6.4 結(jié)論130
• 6.5 參考文獻(xiàn)130-134
• 總結(jié)和展望134-136
• 作者在攻讀博士學(xué)位期間公開發(fā)表的論文136-138
• 致謝138

  本文關(guān)鍵詞：若干酶反應(yīng)抑制劑的研制及檢測(cè)新方法的構(gòu)建，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號(hào)：329511