本文關(guān)鍵詞：Ly108-SAP調(diào)節(jié)T細胞與抗原呈遞細胞相互作用的機制，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：生發(fā)中心是次級淋巴器官中B細胞濾泡區(qū)所分化出來的特殊結(jié)構(gòu),主要由生發(fā)中心B細胞和一些特化的基質(zhì)細胞組成,是B細胞受體(BCR)產(chǎn)生高頻突變、同種型轉(zhuǎn)換從而產(chǎn)生高親和力抗體的區(qū)域。生發(fā)中心反應(yīng)需要抗原特異的T細胞與B細胞的合作,在體內(nèi)主要體現(xiàn)在長時間的T、B細胞相互作用上。淋巴細胞激活信號分子相關(guān)蛋白(Signaling Lymphocytic Activation Molecule(SLAM)-Associated Protein,SAP)是由SH2D1A基因編碼的一種胞內(nèi)接頭蛋白,它僅由一個SH2結(jié)構(gòu)域和C端二十幾個氨基酸組成,在哺乳動物中高度保守,通過結(jié)合SLAM家族分子的胞內(nèi)端進行信號傳導(dǎo),是T、B細胞穩(wěn)定的相互作用所必須的。而SLAM家族分子是一系列的跨膜受體,在T、B以及樹突狀細胞上均有表達,主要進行同型相互作用(homotypic interaction),其成員之一Ly108可能負向的調(diào)節(jié)T、B細胞相互作用。通過細胞共軛結(jié)合實驗(conjugate assay)活體雙光子實時成像技術(shù)、結(jié)構(gòu)化照明顯微鏡技術(shù)等實驗技術(shù)手段,我們的工作表明:除了磷酸化酪氨酸結(jié)合位點以外,SAP并不包含其他基序(motif),因此并不能通過招募其他信號分子來介導(dǎo)T、B細胞相互作用;Ly108不僅僅能抑制T、B細胞相互,而且能抑制T細胞與樹突狀細胞(DC)的相互作用。其機制是Ly108在兩個層次上與CD3相互作用,抑制CD3?的磷酸化,從而抑制T細胞與抗原呈遞細胞的相互作用。在靜息狀態(tài)的細胞中,盡管TCR并沒有被刺激,Ly108也沒有被交聯(lián),Ly108與CD3復(fù)合體會在100-200 nm的分辨率上共定位。由于Ly108與磷酸酶SHP-1持續(xù)結(jié)合,Ly108與CD3的共定位將降低CD3的磷酸化水平,即使在正常的、表達SAP的T細胞中也是如此。當(dāng)Ly108由于細胞-細胞相互作用而被交聯(lián),Ly108將進一步與CD3?相互作用,導(dǎo)致更為有效的CD3?去磷酸化,并且這一過程是依賴于的跨膜域的。如果將Ly108的跨膜域替換掉,靜息狀態(tài)下持續(xù)的Ly108-CD3?共定位及去磷酸化依然存在,但是Ly108交聯(lián)之后的Ly108-CD3?共定位及去磷酸化會喪失,Ly108將不再能抑制抗原特異的T、B相互作用。這些結(jié)果闡明了SAP和Ly108對立的調(diào)節(jié)TCR近端信號(proximal signaling)從而調(diào)控抗原特異的T細胞-抗原呈遞細胞相互作用的機制。本課題首次發(fā)現(xiàn)Ly108獨特的跨膜序列對TCR信號的影響,并且提出了一個全新的SAP蛋白的作用模式。
【關(guān)鍵詞】：SAP Ly108 CD3 活體成像 T-B細胞相互作用
【學(xué)位授予單位】：清華大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：Q25
【目錄】：

• 摘要3-4
• Abstract4-10
• 主要符號對照表10-11
• 第1章 引言11-23
• 1.1 X染色體連鎖的淋巴細胞增多癥11-12
• 1.2 含有SH2結(jié)構(gòu)域的SAP蛋白家族分子12-13
• 1.3 SLAM家族跨膜受體分子13-17
• 1.3.1 概論13
• 1.3.2 SLAM受體基因家族13-16
• 1.3.3 SLAM家族受體分子的同種型16-17
• 1.4 SLAM家族受體分子的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)17-19
• 1.5 生發(fā)中心反應(yīng)19-23
• 1.5.1 生發(fā)中心的結(jié)構(gòu)和功能19-21
• 1.5.2 生發(fā)中心中的T細胞21-23
• 第2章 實驗材料與方法23-47
• 2.1 實驗材料23-30
• 2.1.1 實驗動物23
• 2.1.2 質(zhì)粒23
• 2.1.3 大腸桿菌培養(yǎng)基23-24
• 2.1.4 動物細胞培養(yǎng)基24
• 2.1.5 試劑購買24-25
• 2.1.6 試劑配置25-27
• 2.1.7 蛋白質(zhì)電泳相關(guān)試劑、緩沖液的配制27-28
• 2.1.8 核酸電泳相關(guān)試劑、緩沖液的配制28-29
• 2.1.9 蛋白雜交相關(guān)試劑、緩沖液的配制29
• 2.1.10 主要儀器29-30
• 2.2 實驗方法30-47
• 2.2.1 分離原代T、B淋巴細胞30-31
• 2.2.2 淋巴細胞cDNA的制備31-33
• 2.2.3 普通載體的構(gòu)建33-36
• 2.2.4 基因定點突變36-37
• 2.2.5 轉(zhuǎn)染級質(zhì)粒的提取37
• 2.2.6 逆轉(zhuǎn)錄病毒的包裝37-38
• 2.2.7 T淋巴細胞的體外活化與培養(yǎng)38
• 2.2.8 逆轉(zhuǎn)錄病毒感染T淋巴細胞38-39
• 2.2.9 B淋巴細胞的體外活化與培養(yǎng)39
• 2.2.10 骨髓重建以及樹突狀細胞的分離39-40
• 2.2.11 體外共軛結(jié)合實驗（conjugate assay）40
• 2.2.12 SAP蛋白的胞內(nèi)染色40
• 2.2.13 T細胞表面分子染色及流式分析40-41
• 2.2.14 免疫共沉淀41-42
• 2.2.15 免疫印跡42
• 2.2.16 雙光子活體成像42-43
• 2.2.17 結(jié)構(gòu)化照明顯微鏡樣品的制備及拍攝43-44
• 2.2.18 熒光共振能量轉(zhuǎn)移成像44-45
• 2.2.19 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析45-47
• 第3章 SAP并非通過招募正向信號分子從而促進T、B細胞抗原特異相互作用47-53
• 3.1 本章引論47
• 3.2 實驗結(jié)果47-51
• 3.2.1 SAP蛋白的C端尾部氨基酸并不是T、B細胞穩(wěn)定相互作用所必需的48-49
• 3.2.2 SAP蛋白的同源分子EAT- 2 蛋白的SH2結(jié)構(gòu)域同樣可以拯救SAP敲除的T細胞，，促進抗原特異的T、B相互作用49
• 3.2.3 所有SAP突變分子均可以拯救SAP敲除的T細胞，促進抗原特異的T、B相互作用49-50
• 3.2.4 SAP電荷顛倒突變分子S85R-K 89D同樣可以可以拯救SAP敲除的T細胞50-51
• 3.3 本章小結(jié)與討論51-53
• 第4章 Ly108跨膜蛋白可以抑制T、B以及T、DC抗原特異的相互作用53-57
• 4.1 本章引論53
• 4.2 實驗結(jié)果53-56
• 4.2.1 SLAM家族受體分子Ly108能抑制T、B細胞的相互作用53
• 4.2.2 在DC上強迫性過表達Ly108同樣能抑制T、DC相互作用53-56
• 4.3 本章小結(jié)與討論56-57
• 第5章 SAP通過替換Ly108胞內(nèi)端結(jié)合的SHP-1 從而促進T、B細胞相互作用57-62
• 5.1 本章引論57
• 5.2 實驗結(jié)果57-60
• 5.2.1 野生型細胞而非SAP敲除細胞中，結(jié)合在Ly108胞內(nèi)端的SHP-1隨著TCR刺激而減少57-58
• 5.2.2 游離的Ly108胞內(nèi)端可以競爭性的減少結(jié)合在Ly108分子上的SHP- 158-59
• 5.2.3 游離的Ly108胞內(nèi)端可以在體外T、B共軛結(jié)合實驗中拯救SAP敲除的T細胞59
• 5.2.4 在小鼠體內(nèi)，細胞膜上的Ly108- SHP- 1 復(fù)合體抑制了T、B細胞的抗原特異相互作用59-60
• 5.3 本章小結(jié)與討論60-62
• 第6章 SAP和Ly108通過調(diào)節(jié)CD3z周圍的SHP-1 來調(diào)控CD3ζ的磷酸化程度62-67
• 6.1 本章引論62
• 6.2 實驗結(jié)果62-64
• 6.2.1 SAP蛋白在TCR受體識別抗原后的T、B相互作用早期就是必需的62
• 6.2.2 Ly108- SHP- 1 復(fù)合體降低CD3ζ的磷酸化水平62-64
• 6.2.3 Ly108與CD3ζ在細胞膜上持續(xù)共定位64
• 6.3 本章小結(jié)與討論64-67
• 第7章 Ly108的胞內(nèi)端和跨膜域影響Ly108與TCR復(fù)合體的共定位67-76
• 7.1 本章引論67
• 7.2 實驗結(jié)果67-74
• 7.2.1 Ly108的胞內(nèi)端影響Ly108與TCR復(fù)合體的共定位69
• 7.2.2 Ly108被招募到T、B細胞相互作用形成的免疫突觸中69
• 7.2.3 Ly108的反式交聯(lián)不依賴于TCR和SAP69-71
• 7.2.4 Ly108的反式交聯(lián)導(dǎo)致其進一步與TCR復(fù)合體共定位及相互作用，并且該過程依賴于Ly108的跨膜域71-72
• 7.2.5 Ly108的跨膜域是Ly108抑制CD3ζ的磷酸化從而抑制T、B細胞抗原特異相互作用所必需的72-74
• 7.2.6 Ly108的跨膜域中的TISIIS氨基酸是其抑制作用所必須的74
• 7.3 本章小結(jié)與討論74-76
• 第8章 討論與展望76-81
• 參考文獻81-103
• 致謝103-105
• 個人簡歷、在學(xué)期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文與研究成果105

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1 ;2012年諾貝爾化學(xué)獎研究成果——“G蛋白偶聯(lián)受體”解開20世紀最難解之謎[J];山東大學(xué)學(xué)報(理學(xué)版);2012年11期

2 胡為民,程驚秋,李勝富,盧曉風(fēng),萬琳,李幼平;人外周血單個核細胞與豬內(nèi)皮細胞相互作用表達上調(diào)基因的鑒定[J];四川大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版);2003年02期

3 張卉U

本文編號：329170