本文關(guān)鍵詞：重組再生蛋白3的表達(dá)及抗菌活性的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景： 哺乳動(dòng)物腸道內(nèi)生長(zhǎng)著大量的細(xì)菌，這些細(xì)菌和宿主保持著共生關(guān)系。同時(shí)，，腸道也是病原微生物進(jìn)入宿主體內(nèi)的主要通道。要面對(duì)如此復(fù)雜的微生物環(huán)境而不致病，腸道粘膜細(xì)胞產(chǎn)生各種內(nèi)源性抗菌物質(zhì)，來保持對(duì)腸腔內(nèi)細(xì)菌的動(dòng)態(tài)限制，否則如果細(xì)菌透過腸粘膜進(jìn)入血液中就會(huì)導(dǎo)致感染和菌血癥。 再生蛋白3（regenerating protein3，Reg3）是一組由小腸paneth細(xì)胞分泌到腸腔的抗菌蛋白，大小約為16KD，包括小鼠Reg3γ和人Reg3A。我們既往研究發(fā)現(xiàn)小鼠腸道內(nèi)細(xì)菌感染或葡聚糖硫酸酯鈉(DSS)誘導(dǎo)的小鼠腸炎模型中，小鼠腸粘膜細(xì)胞Reg3γmRNA明顯上調(diào)。炎性腸道病患者腸道粘膜再生蛋白R(shí)eg3AmRNA也明顯上調(diào)。越來越多的研究表明再生蛋白3在調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物腸道內(nèi)細(xì)菌和宿主之間的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定具有重要的意義。 除了抗菌作用外，再生蛋白3還參與多種類型細(xì)胞的增殖和分化，并且具有抗凋亡和促有絲分裂等作用，與糖尿病、腫瘤及炎性腸道病等多種疾病相關(guān)。目前，對(duì)于該類蛋白的表達(dá)和調(diào)控，抗菌功能功能的具體機(jī)制還不清楚。所以利用生物工程技術(shù)體外表達(dá)重組再生蛋白3對(duì)于進(jìn)一步深入研究其各種功能及作用機(jī)制有重要的意義。 研究目的： 1、建立高效的重組小鼠Reg3γ和人Reg3A在大腸桿菌中的表達(dá)、純化方法。 2、對(duì)重組蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定及分析。 3、對(duì)重組蛋白質(zhì)進(jìn)行體外抗菌功能的初步測(cè)定。 研究方法： 1、根據(jù)Reg3(小鼠Reg3γ和人Reg3A)的cDNA序列通過PCR擴(kuò)增，并插入pET30b (+)質(zhì)粒。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，質(zhì)粒擴(kuò)增后提純鑒定。構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化蛋白質(zhì)表達(dá)大腸桿菌BL21-CodonPlus (DE3)-RIL，通過IPTG誘導(dǎo)進(jìn)行表達(dá)。大腸桿菌通過超聲破碎，包涵體蛋白質(zhì)變性溶解后復(fù)性、透析，所得重組蛋白通過離子交換層析及分子篩凝膠過濾進(jìn)行純化。 2、對(duì)重組Reg3蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定。通過考馬斯亮蘭染色和Westernblotting對(duì)重組蛋白進(jìn)行鑒定。重組蛋白行體外胰蛋白酶酶切，酶切產(chǎn)物進(jìn)行可溶性檢測(cè)。 3、通過平板菌落計(jì)數(shù)（CFU）方法對(duì)Reg3γ和Reg3A重組蛋白及其酶切蛋白進(jìn)行體外抗菌功能分析。研究細(xì)菌選用革蘭氏陽性的糞腸球菌和革蘭氏陰性的大腸桿菌。 數(shù)據(jù)均用SPSS軟件分析v20.0（IBM，USA）。組間數(shù)據(jù)比較使用independent t test, P＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果： 1、重組質(zhì)粒的構(gòu)建 為了進(jìn)一步研究再生蛋白3的相關(guān)功能，我們通過基因工程技術(shù)重組表達(dá)了小鼠Reg3γ和人Reg3A蛋白。根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)提供的基因序列設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增目的基因，將鼠Reg3γ和人Reg3A基因插入pET-30b(+)質(zhì)粒成功構(gòu)建成重組質(zhì)粒pET-30b(+)-Reg3γ和pET-30b(+)-Reg3A。 2、重組Reg3蛋白質(zhì)在大腸桿菌中的表達(dá)、純化及鑒定 本研究通過小量制備確定了重組Reg3γ和Reg3A蛋白質(zhì)在大腸桿菌中表達(dá)的最佳誘導(dǎo)條件：IPTG誘導(dǎo)濃度使用0.5mM/L，誘導(dǎo)時(shí)間為6小時(shí)。小量制備結(jié)果顯示重組Reg3γ和Reg3A蛋白質(zhì)在大腸桿菌中表達(dá)形式是不溶的包涵體狀態(tài)，與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)相符。為取得有功能的重組蛋白需要進(jìn)一步行包涵體的溶解復(fù)性和純化。 根據(jù)小量制備確定的條件，我們進(jìn)行了重組Reg3γ和Reg3A蛋白的大量表達(dá)。大量表達(dá)的重組蛋白在細(xì)菌中形成包涵體。使用重懸緩沖液將經(jīng)過超聲碎裂細(xì)菌后釋放的包涵體溶解，加入到復(fù)性液中。復(fù)性后的重組蛋白通過雙重透析析出小分子雜質(zhì)，經(jīng)過濾及離子交換層析初步純化。重組蛋白經(jīng)進(jìn)一步凝膠過濾純化后，除去重組蛋白中的大分子雜質(zhì)。 重組Reg3γ和Reg3A蛋白經(jīng)考馬斯亮蘭染色和Westernblotting鑒定確認(rèn)蛋白表達(dá)成功。我們還對(duì)兩種重組蛋白進(jìn)行胰蛋白酶體外酶切，確認(rèn)了重組Reg3γ和Reg3A蛋白質(zhì)和其它再生蛋白家族成員類似可以被胰蛋白酶水解成較小的蛋白質(zhì)。我們還檢測(cè)了酶切重組蛋白質(zhì)的可溶性變化，發(fā)現(xiàn)重組Reg3γ和Reg3A蛋白質(zhì)在酶切后具有有不溶的傾向。 3、重組蛋白體外抗菌活性的研究 通過CFU(colony forming units)檢測(cè)方法證明了重組Reg3γ和Reg3A蛋白對(duì)革蘭氏陽性菌（糞腸球菌）有體外抗菌活性。該抗菌活性可在重組蛋白被胰蛋白酶酶切后明顯增強(qiáng)。兩種重組再生蛋白對(duì)革蘭氏陰性大腸桿菌無明顯體外抗菌活性。 綜上，本研究將為進(jìn)一步研究再生蛋白3的功能及作用機(jī)制提供了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：再生蛋白 蛋白質(zhì) 表達(dá) 純化
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：Q51;Q78
【目錄】：

• 前言4-5
• 中文摘要5-9
• Abstract9-14
• 英文縮寫詞表14-16
• 第1章 緒論16-28
• 1.1 再生蛋白家族各成員的發(fā)現(xiàn)和命名16-18
• 1.2 再生蛋白家族的功能和相關(guān)疾病18-24
• 1.2.1 再生蛋白家族的抗菌作用18-20
• 1.2.2 再生蛋白家族與糖尿病20-22
• 1.2.3 再生蛋白家族與炎癥、創(chuàng)傷反應(yīng)22-23
• 1.2.4 再生蛋白家族與腫瘤23-24
• 1.3 再生蛋白家族表達(dá)調(diào)控24-26
• 1.4 課題的研究意義26
• 1.5 技術(shù)路線26-28
• 第2章 材料與方法28-52
• 2.1 重組質(zhì)粒構(gòu)建28-37
• 2.1.1 材料28-30
• 2.1.2 方法30-37
• 2.2 重組蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)及純化37-46
• 2.2.1 材料37-41
• 2.2.2 方法41-46
• 2.3 重組蛋白的鑒定46-49
• 2.3.1 材料46-47
• 2.3.2 方法47-49
• 2.4 重組蛋白體外抗菌活性研究49-52
• 2.4.1 材料49-50
• 2.4.2 方法50-52
• 第3章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果52-66
• 3.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建52-55
• 3.1.1 目的基因的擴(kuò)增和鑒定52
• 3.1.2 載體構(gòu)建方式52-53
• 3.1.3 菌液直接 PCR 鑒定53-54
• 3.1.4 重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定54-55
• 3.2 重組 Reg3 蛋白質(zhì)在大腸桿菌中的表達(dá)和純化55-60
• 3.2.1 重組蛋白的小量制備55-57
• 3.2.2 重組蛋白的表達(dá)和純化57-60
• 3.3 重組蛋白的鑒定60-63
• 3.4 重組蛋白體外抗菌活性研究63-66
• 第4章 討論66-72
• 4.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建和表達(dá)菌株的選擇66-67
• 4.2 重組 Reg3 蛋白質(zhì)在大腸桿菌中的表達(dá)、純化及鑒定67-69
• 4.3 重組蛋白體外抗菌活性的研究69-72
• 第5章 結(jié)論72-74
• 參考文獻(xiàn)74-84
• 作者簡(jiǎn)介84-86
• 攻讀博士期間所得的科研成果86-87
• 致謝87

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：329158