本文關(guān)鍵詞：釀酒酵母PMT1基因缺失延長細胞復制壽命的機制研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：釀酒酵母蛋白質(zhì)-氧-甘露糖轉(zhuǎn)移酶(Protein-O-mannosyltransferase, PMT)家族共有七個成員(Pmtlp-Pmt7p),這些成員從酵母到哺乳動物都存在一定的保守性。PMT家族蛋白都定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng),主要通過調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)未折疊蛋白質(zhì)反應(unfolded protein response, UPR)參與調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)的動態(tài)平衡。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激感應因子Irel和轉(zhuǎn)錄因子Hacl參與調(diào)控UPR通路下游靶基因的表達,這些靶基因增強內(nèi)質(zhì)網(wǎng)對未折疊或錯誤折疊蛋白質(zhì)的折疊處理能力,減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激。在這一過程中,HAClmRNA被剪接是UPR通路激活的關(guān)鍵步驟。研究顯示UPR和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激在多種物種的衰老和衰老相關(guān)疾病的發(fā)生和發(fā)展中具有重要作用。研究內(nèi)容與實驗方法如下：1.依據(jù)基因同源重組的原理構(gòu)建PMT家族單基因缺失(pmtl △～pmt6A)酵母菌株、PMT1與HAC1或IRE1雙基因缺失(pmtl△hacl△和pmtl△irel△)酵母菌株模型。在Scope A I光學顯微鏡下,用玻璃纖維針對酵母母細胞和子細胞進行分離,并計數(shù)子細胞數(shù)量,統(tǒng)計分析酵母細胞復制壽命,研究PMT家族成員是否參與調(diào)控酵母細胞的復制壽命。采用RT-PCR檢測pmtl△菌株中HACl mRNA的剪接情況,實時熒光定量PCR檢測UPR通路中部分靶基因的轉(zhuǎn)錄水平,Western Blot檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶分子Kar2蛋白的表達水平,以探討PMTl調(diào)控酵母細胞復制壽命與UPR信號通路的關(guān)系；2.依據(jù)基因同源重組的原理成功構(gòu)建TED1基因缺失(tedl△)酵母菌株,PMTl與TED1雙基因缺失(pmtl△tedl△)酵母菌株(Pmtlp和Tedlp形成復合物),以及PMT1與TED1和HAC1三基因缺失Cpmtl△tedl△hacl△)酵母菌株模型。采用酵母細胞復制壽命檢測方法和實時熒光定量PCR方法,分析酵母菌株的壽命變化和UPR通路活性變化,研究PMT1與TED1在壽命調(diào)控方面是否存在關(guān)聯(lián),探討UPR信號通路調(diào)控壽命的可能機制。3.分別用衣霉素和剛果紅/熒光增白劑作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激和細胞壁應激的誘導劑,通過單克隆形成實驗方法觀察PMT1與TED1對細胞應激的敏感性。研究酵母細胞應激能力與UPR信號通路和細胞壁完整性通路的關(guān)系,進而探討酵母細胞復制壽命與應激能力之間的調(diào)控關(guān)系。結(jié)果及結(jié)論如下：1.在PMT家族基因缺失酵母菌株中,僅pmtl△菌株平均復制壽命延長約20%(p0.0001),缺失HAC1或IRE1基因能縮短pmtl△菌株的復制壽命。缺失PMT1基因能誘導HAC1 mRNA剪接,進而上調(diào)UPR通路中部分下游靶基因的表達水平,這些靶基因包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶分子(KAR2和LHS1),參與蛋白質(zhì)輸出的基因(FKB2)和氧化折疊的基因(EUG1和ERO1)。同時,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶分子Kar2蛋白表達水平也明顯上調(diào)。這些結(jié)果提示PMT1基因缺失延長酵母細胞的復制壽命,壽命延長與UPR活性上調(diào)相關(guān)；2.與野生型酵母菌株比較,tedl△菌株平均復制壽命明顯縮短約14%(p0.001),缺失PMT1基因能明顯延長tedl△菌株的復制壽命,壽命延長依賴HAC1的存在。并且,缺失PMT1基因能誘導tedl△菌株HAC1 mRNA的剪接,上調(diào)UPR靶基因的表達水平。該結(jié)果提示缺失PMT1基因可能通過上調(diào)UPR活性來恢復tedl△菌株較短的復制壽命。3.野生型酵母菌株中缺失PMT1基因?qū)?nèi)質(zhì)網(wǎng)應激敏感,但是在hacl△菌株中缺失PMT1基因可以增強細胞對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的抗性。缺失PMT1基因可以導致tedl△菌株對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激和細胞壁應激的敏感性。這表明長壽命的酵母菌株不一定具有較強的應激能力。綜上所述,缺失PMT1基因可以延長野生型酵母細胞及tedl△菌株的復制壽命,壽命延長與UPR通路活性相關(guān)；盡管PMT1基因缺失可以誘導保護性UPR靶基因和參與細胞壁應激反應轉(zhuǎn)錄因子的表達上調(diào),但是沒有增強酵母細胞的應激能力。這提示酵母細胞復制壽命與應激能力之間復雜的調(diào)控關(guān)系還有待進一步深入研究。
【關(guān)鍵詞】：糖基化 酵母 復制性壽命 未折疊蛋白質(zhì)反應
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R339.36
【目錄】：

• 英漢縮略語名詞對照6-7
• 中文摘要7-10
• 英文摘要10-13
• 前言13-19
• 第一部分 釀酒酵母PMT家族基因缺失對細胞復制壽命的影響19-48
• 1 材料與方法19-35
• 2 結(jié)果35-45
• 3 討論45-47
• 4 小結(jié)47-48
• 第二部分 PMT1基因缺失延長TED1基因缺失菌株的復制壽命48-62
• 1 材料與方法48-54
• 2 結(jié)果54-60
• 3 討論60-61
• 4 小結(jié)61-62
• 第三部分 PMT1和TED1調(diào)節(jié)酵母細胞應激反應62-71
• 1 材料與方法62-64
• 2 結(jié)果64-68
• 3 討論68-70
• 4 小結(jié)70-71
• 全文總結(jié)71-72
• 本論文的特色與創(chuàng)新之處72-73
• 不足之處與后續(xù)研究73-74
• 參考文獻74-81
• 附圖81-85
• 文獻綜述85-95
• 參考文獻91-95
• 致謝95-96
• 攻讀博士學位期間發(fā)表的論文及主持與參與科研項目的情況96-97

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