本文關(guān)鍵詞：我國雞馬立克氏病毒流行毒株生物學(xué)特性分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：雞馬立克氏病(MD)是由雞馬立克氏病病毒(MDV)引起的一種高度接觸性傳染性疾病。發(fā)病雞表現(xiàn)為精神萎靡、麻痹、共濟(jì)失調(diào)、翅膀下垂、呆立,被毛凌亂等臨床癥狀,剖檢可見內(nèi)臟和其他器官發(fā)生淋巴增生性腫瘤。同時(shí),該病可引起發(fā)病雞只的免疫抑制,造成其他病原的繼發(fā)感染。MD呈世界范圍內(nèi)的流行,每年造成的直接經(jīng)濟(jì)損失在10~20億美元。疫苗免疫是控制該病的主要手段。MD疫苗免疫屬于非清除性免疫,不能夠阻止野毒株的感染及排毒,導(dǎo)致野毒株與疫苗毒株長期共存于同一機(jī)體,促使野毒株毒力進(jìn)化。過去的幾十年里,MDV持續(xù)性演化,同期使用的MD疫苗保護(hù)效果不理想。近些年我國小型養(yǎng)禽場甚至規(guī)�；B(yǎng)禽場也常有MD發(fā)生,并且常伴隨其它臨床表現(xiàn)不明顯的免疫抑制病病原REV,ALV和CIAV等的混合感染,給養(yǎng)雞業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。因此有必要了解我國近年來雞群中MDV感染和流行,以及其與免疫抑制病毒混合感染的情況;分析我國的MDV野毒株的致病特征和毒力變異規(guī)律;評價(jià)現(xiàn)有MD疫苗的免疫保護(hù)效果;分析MDV野毒株的主要致病相關(guān)基因和病毒基因組的分子特征,研究其進(jìn)化規(guī)律。這些對MDV的基礎(chǔ)研究和我國MD的防控均具有極其重要的意義。本研究于2011年~2013年間,在黑龍江、吉林、遼寧、山東、河北、江蘇、內(nèi)蒙古、湖南、河南和廣東等10個(gè)省份的136個(gè)蛋雞或種雞群,從臨床表現(xiàn)和病理變化疑似發(fā)生MD的雞無菌采集羽髓或抗凝血,共計(jì)522份。經(jīng)PCR檢測,522份樣品中MDV陽性樣品334份,陽性率為64%;檢測的136個(gè)雞場中95個(gè)雞群中MDV感染陽性率為69.9%;應(yīng)用PCR,間接免疫熒光和/或ELISA等檢測方法,對所有MDV陽性樣品進(jìn)行了其他免疫抑制病病毒-REV、ALV和CIAV的檢測,結(jié)果表明MD陽性雞群中REV、ALV和CIAV的陽性率分別為11.7%、21.0%和21.3%,存在著較為嚴(yán)重的混合感染,甚至三重和四重感染;從MDV陽性樣品中分離獲得45株適應(yīng)細(xì)胞的病毒株,其中43株經(jīng)PCR,間接免疫熒光和/或ELISA等檢測證實(shí)為REV、ALV和CIAV陰性,經(jīng)MDV的132堿基重復(fù)序列(132bpr)的PCR檢測分析,證實(shí)獲得的43株分離毒株含有2個(gè)或3個(gè)拷貝的132bp均具有MDV野毒株的特征,而另外2株經(jīng)PCR、蝕斑、間接免疫熒光和電鏡等方法鑒定,證實(shí)為MDV和REV混感的細(xì)胞培養(yǎng)物。對43株新分離的MDV野毒株及其他的MDV參考毒株的主要致腫瘤基因-meq基因序列比對和分析,結(jié)果顯示中國流行毒株meq基因編碼的Meq蛋白的主要分子特征為:77E,80Y,115A,139A,176R和217A;對meq的遺傳進(jìn)化分析表明中國商品蛋雞或種雞群中流行的MDV具有遺傳進(jìn)化多樣性,meq基因存在新的變異。為研究中國MDV流行毒株的致病特征以及MDV混感REV對SPF雞的影響,選取具有中國流行毒株meq基因典型特征、且臨床發(fā)病率高和死亡率高的3株MDV分離毒(LCC,LLY和LTS株),以及1個(gè)MDV和REV混感培養(yǎng)物進(jìn)行了致病性分析。結(jié)果表明3株MDV野毒株感染的SPF雞各具不同的發(fā)病特征,試驗(yàn)結(jié)束時(shí)剖檢可見絕大多數(shù)LLY和LTS接種雞發(fā)生明顯的內(nèi)臟腫瘤,而LCC接種雞無肉眼可見腫瘤,但組織病理觀察可見LCC攻毒組雞內(nèi)臟組織發(fā)生腫瘤細(xì)胞浸潤。這些結(jié)果提示不同野毒株誘導(dǎo)的腫瘤發(fā)生時(shí)間是不一致的。3株病毒均能引起SPF雞100%發(fā)病,但是死亡率較低,LCC,LLY和LTS攻毒組雞只死亡率別為42.9%,46.7%和23.1%。MDV和REV的混合培養(yǎng)物-CYM+R卻能引起SPF雞100%的腫瘤率和93.3%的死亡率;組織病理學(xué)觀察可見肝臟、脾臟、腎臟和腺胃等均出現(xiàn)以多形態(tài)的淋巴細(xì)胞增生浸潤為主的病灶,這些浸潤的淋巴細(xì)胞包括小型、中型和大型淋巴細(xì)胞,取代部分原來的正常組織(腺胃);免疫組化可見腺胃腺管上皮細(xì)胞呈棕褐染色,分布于整個(gè)纖維組織。這表明MDV與REV混合感染對雞群的危害更嚴(yán)重。本研究也評價(jià)了現(xiàn)有MD疫苗(CVI988株)對MDV流行毒株的免疫保護(hù)效果。免疫后接種MDV LCC,LLY和LTS株的雞只發(fā)病率分別為14.3%、7.7%,和33.3%,MD疫苗(CVI988株)對它們的免疫保護(hù)指數(shù)分別為85.7,92.3和66.7。表明現(xiàn)有疫苗對不同MDV流行毒株的保護(hù)效果存在顯著的差異。為研究MDV流行毒株在雞體內(nèi)的復(fù)制能力及疫苗對野毒株復(fù)制的干擾能力,通過熒光定量PCR法動(dòng)態(tài)檢測了羽髓中病毒的載量。結(jié)果表明LCC和LTS株在攻毒后14和17d病毒載量達(dá)到高峰,每百萬個(gè)宿主細(xì)胞中108個(gè)拷貝數(shù)以上,LLY攻毒在攻毒后17d病毒載量達(dá)到高峰。3株病毒攻毒后21~60d維持在106個(gè)/拷貝數(shù)百萬個(gè)宿主細(xì)胞以上,均顯著高于免疫攻毒組的病毒載量(P≤0.05)。免疫后LTS攻毒雞在17~21d也能達(dá)到每百萬個(gè)宿主細(xì)胞中106個(gè)拷貝數(shù)以上,而免疫后LCC和LLY攻毒組病毒載量在106個(gè)拷貝以下。CVI988對LTS株在體內(nèi)復(fù)制的干擾能力較低,這可以部分解釋疫苗保護(hù)水平低的原因。利用細(xì)菌人工染色體技術(shù),對MDV和REV的混合培養(yǎng)物CYM+R中的MDV進(jìn)行分子純化,獲得一株純凈的MDV毒株,并通過二代全基因組測序分析其全病毒基因組。遺傳進(jìn)化樹分析表明該株MDV毒株表現(xiàn)出與中國流行毒株具有非常接近的遺傳進(jìn)化關(guān)系,并未有明顯的進(jìn)化。表明MDV和REV的混合培養(yǎng)物-CYM+R的高致病能力并不是其中的MDV毒株發(fā)生顯著進(jìn)化造成的,更有可能是由于其于REV混合感染的結(jié)果。綜上所述,本研究對我國MDV的流行情況進(jìn)行了廣泛的調(diào)查和分析,對MDV流行毒株的分子特征、遺傳進(jìn)化規(guī)律、致病特征、體內(nèi)復(fù)制特點(diǎn)和現(xiàn)有MD疫苗對流行毒株的免疫保護(hù)效果進(jìn)行了較為全面系統(tǒng)的研究和分析。同時(shí)對現(xiàn)地發(fā)生的MDV與其他免疫抑制病病原混感的情況進(jìn)行了調(diào)查,并選擇MDV與REV混感作為研究對象,分析了混感在MDV流行中的作用。本研究對MDV的基礎(chǔ)研究和MD的防控具有重要意義。
【關(guān)鍵詞】：雞馬立克氏病毒 流行毒株 致病特點(diǎn)
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S852.65
【目錄】：

• 摘要8-10
• 英文摘要10-13
• 1 引言13-23
• 1.1 本研究課題的國內(nèi)外研究現(xiàn)狀及發(fā)展動(dòng)態(tài)分析13-22
• 1.1.1 雞馬立克氏病和雞馬立克氏病病毒13-14
• 1.1.2 MDV的傳播及感染14-15
• 1.1.3 MDV基因組及致瘤基因15-19
• 1.1.4 MDV的進(jìn)化及機(jī)制19-22
• 1.2 本研究課題的目的和意義22-23
• 2 材料和方法23-33
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料23-24
• 2.1.1 病毒株、血清和單抗23
• 2.1.2 主要試劑23
• 2.1.3 主要耗材23
• 2.1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物23-24
• 2.1.5 儀器24
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法24-33
• 2.2.1 MD的流行病學(xué)及MDV與其他免疫抑制病毒的混感調(diào)查24-26
• 2.2.2 MDV野毒株分離與鑒定26-27
• 2.2.3 MDV野毒株meq基因序列測定及分析27
• 2.2.4 MDV野毒株致病性分析27-29
• 2.2.5 MDV+REV分離物致病性分析29-30
• 2.2.6 分離物CYM+R中MDV的BAC克隆的構(gòu)建30
• 2.2.7 分離物CYM+R中MDV的BAC克隆的基因組序列測定30-31
• 2.2.8 統(tǒng)計(jì)分析31-33
• 3 結(jié)果與分析33-55
• 3.1 MDV的流行病學(xué)及其與其他免疫抑制病毒的混感調(diào)查33-34
• 3.1.1 MD的檢測33
• 3.1.2 MDV與REV、ALV和CIAV的混合感染33-34
• 3.1.3 MDV與REV、ALV和CIAV的多重感染情況34
• 3.2 MDV野毒株與MDV+REV分離物的分離與鑒定34-38
• 3.2.1 MDV野毒株的分離與鑒定34-37
• 3.2.2 MDV+REV分離物的分離與鑒定37-38
• 3.3 MDV野毒株meq基因序列測定和分析38-44
• 3.3.1 MDV分離株meq基因序列分子特征38
• 3.3.2 MDV分離株meq基因遺傳進(jìn)化分析38-44
• 3.4 MDV野毒株致病性分析44-48
• 3.4.1 MDV代表毒株的選擇及鑒定44-45
• 3.4.2 發(fā)病率和死亡率45-46
• 3.4.3 MD腫瘤的分布46-47
• 3.4.4 組織學(xué)觀察47
• 3.4.5 羽髓中MDV基因組載量的動(dòng)態(tài)分析47-48
• 3.5 MDV+REV分離物的致病性分析48-51
• 3.5.1 MDV+REV分離物效價(jià)的測定48
• 3.5.2 發(fā)病率和死亡率48-49
• 3.5.3 組織學(xué)和免疫組化觀察49-50
• 3.5.4 羽髓中MDV和REV基因組載量動(dòng)態(tài)分析50-51
• 3.6 分離物CYM+R中MDV的純化51-52
• 3.6.1 CYM-BAC克隆的鑒定51-52
• 3.6.2 拯救的重組病毒的鑒定52
• 3.7 CYM-BAC的基因組序列分析52-55
• 3.7.1 CYM-BAC的基因組概況52
• 3.7.2 GO數(shù)據(jù)庫注釋52-53
• 3.7.3 KEGG數(shù)據(jù)庫注釋53
• 3.7.4 CYM-BAC遺傳進(jìn)化分析53-55
• 4 討論55-59
• 4.1 MDV的感染及其與其他免疫抑制病毒的混感55-56
• 4.2 分離毒株meq基因的分子特征56-57
• 4.3 MDV分離毒株致病性特征57
• 4.4 MDV混感REV的致病性分析57-59
• 5 結(jié)論59-60
• 致謝60-61
• 參考文獻(xiàn)61-68
• 附錄68-69
• 攻讀博士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文69

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