發(fā)布時(shí)間：2021-05-06 09:22

　　豆科植物與根瘤菌之間共生固氮關(guān)系的建立,需要寄、宿主雙方對對方信號(hào)的接受和反饋。豆科植物釋放類黃酮,根瘤菌接受類黃酮信號(hào)之后誘導(dǎo)結(jié)瘤相關(guān)基因表達(dá),并分泌結(jié)瘤因子;豆科植物在感知結(jié)瘤因子信號(hào)之后,開啟信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò),啟動(dòng)共生結(jié)瘤相關(guān)基因的表達(dá),最終形成共生體—根瘤。百脈根中感知結(jié)瘤因子信號(hào)的是兩個(gè)Lys M類受體激酶NFR1/NFR5,并向下游效應(yīng)基因傳遞結(jié)瘤因子信號(hào)。盡管我們知道其下游的效應(yīng)基因是SYMRK,但是如何傳遞的機(jī)制不清楚。研究表明ROP6與NFR5相互作用,并通過調(diào)節(jié)侵入線的發(fā)育正調(diào)控結(jié)瘤。本研用ROP6為誘餌蛋白,從百脈根AD-c DNA文庫篩選與其相互作用蛋白來展開,主要結(jié)果如下:1.以ROP6為誘餌蛋白,通過酵母雙雜交技術(shù)從百脈根AD-c DNA文庫中篩選分離到網(wǎng)格重鏈蛋白CHC2,體外pull-down實(shí)驗(yàn)和煙草葉片雙分子熒光互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了ROP6與CHC2的相互作用。用生物信息學(xué)的方法分析CHC2的結(jié)構(gòu),并根據(jù)結(jié)構(gòu)將CHC2截成9個(gè)不同大小區(qū)段,鑒定出與ROP6相互作用的結(jié)構(gòu)域。2.克隆百脈根另一個(gè)CHC基因—CHC6以及幾個(gè)百脈根小G蛋白,利用酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)... 

【文章來源】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)湖北省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：119 頁

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略語表
1 前言
    1.1 共生固氮的概念及意義
    1.2 豆科植物與根瘤菌根瘤共生固氮體系
        1.2.1 根瘤菌與豆科植物
        1.2.2 根瘤的形成
    1.3 根瘤菌中參與的結(jié)瘤基因
    1.4 結(jié)瘤因子
    1.5 結(jié)瘤因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑
        1.5.1 結(jié)瘤因子受體激酶
        1.5.2 結(jié)瘤因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑
    1.6 小G蛋白
        1.6.1 小G蛋白的結(jié)構(gòu)及調(diào)節(jié)機(jī)制
        1.6.2 小G蛋白的分類
        1.6.3 小G蛋白生物學(xué)功能
    1.7 網(wǎng)格蛋白
        1.7.1 網(wǎng)格重鏈蛋白
        1.7.2 網(wǎng)格輕鏈蛋白
        1.7.3 網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的胞吞作用機(jī)制
        1.7.4 網(wǎng)格蛋白的功能
        1.7.5 磷酸化調(diào)節(jié)網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的受體內(nèi)吞
    1.8 本實(shí)驗(yàn)的研究目的和意義
2 材料與方法
    2.1 材料
        2.1.1 植物材料
        2.1.2 菌株
        2.1.3 質(zhì)粒
        2.1.4 主要分子生物學(xué)試劑
        2.1.5 常用培養(yǎng)基配方
            2.1.5.1 大腸桿菌培養(yǎng)基
            2.1.5.2 酵母培養(yǎng)基
            2.1.5.3 根瘤菌培養(yǎng)基
            2.1.5.4 植物生長培養(yǎng)基
            2.1.5.5 毛根轉(zhuǎn)化生根培養(yǎng)基
    2.2 材料
        2.2.1 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化
            2.2.1.1 培養(yǎng)基
            2.2.1.2 緩沖液
            2.2.1.3 感受態(tài)細(xì)胞的制備
            2.2.1.4 大腸桿菌轉(zhuǎn)化
        2.2.2 農(nóng)桿菌電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化
            2.2.2.1 培養(yǎng)基
            2.2.2.2 緩沖液
            2.2.2.3 農(nóng)桿菌電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的制備
            2.2.2.4 農(nóng)桿菌電轉(zhuǎn)化
        2.2.3 LiAc法酵母感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化
            2.2.3.1 培養(yǎng)基
            2.2.3.2 緩沖液及試劑
            2.2.3.3 酵母感受態(tài)細(xì)胞的制備
            2.2.3.4 酵母轉(zhuǎn)化
                2.2.3.4.1 小樣轉(zhuǎn)化體系
                2.2.3.4.2 酵母轉(zhuǎn)化
        2.2.4 發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的毛根轉(zhuǎn)化
            2.2.4.1 培養(yǎng)基
            2.2.4.2 緩沖液及試劑
            2.2.4.3 毛根轉(zhuǎn)化
                2.2.4.3.1 外植體的獲得
                2.2.4.3.2 農(nóng)桿菌準(zhǔn)備
                2.2.4.3.3 侵染及誘導(dǎo)生根
            2.2.4.4 毛根鑒定
        2.2.5 雙分子熒光互補(bǔ)（BiFc）實(shí)驗(yàn)
            2.2.5.1 原理及觀察
            2.2.5.2 煙草葉片轉(zhuǎn)化
                2.2.5.2.1 緩沖液及試劑
                2.2.5.2.2 煙草葉片轉(zhuǎn)化
            2.2.5.3 煙草葉片總蛋白抽提
                2.2.5.3.1 緩沖液
                2.2.5.3.2 煙草葉片總蛋白抽提
        2.2.6 酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)
            2.2.6.1 原理
            2.2.6.2 酵母Mating
                2.2.6.2.1 培養(yǎng)基
                2.2.6.2.2 小樣Mating
            2.2.6.3 β-半乳糖苷酶活性檢測
                2.2.6.3.1 緩沖液及試劑
                2.2.6.3.2 β-半乳糖苷酶活性檢測
                2.2.6.3.3 β-半乳糖苷酶活性測定
        2.2.7 標(biāo)簽融合蛋白質(zhì)的原核表達(dá)及純化
            2.2.7.1 緩沖液及試劑
            2.2.7.2 標(biāo)簽融合蛋白質(zhì)原核表達(dá)
            2.2.7.3 His-Tag融合蛋白的純化
            2.2.7.4 MBP-Tag融合蛋白的純化
        2.2.8 蛋白質(zhì)體外相互作用實(shí)驗(yàn)
            2.2.8.1 蛋白質(zhì)體外Pull-down實(shí)驗(yàn)
            2.2.8.2 蛋白質(zhì)體外競爭性實(shí)驗(yàn)
            2.2.8.3 Western-Blot
                2.2.8.3.1 緩沖液及試劑
                2.2.8.3.2 Western-Blot
        2.2.9 RNA操作
            2.2.9.1 根總RNA的抽提
            2.2.9.2 cDNA第一鏈合成
        2.2.10 毛根轉(zhuǎn)化植株接種及結(jié)瘤結(jié)果統(tǒng)計(jì)
3 結(jié)果與分析
    3.1 百脈根網(wǎng)格重鏈蛋白
        3.1.1 百脈根網(wǎng)格重鏈蛋白的分離與鑒定
        3.1.2 百脈根網(wǎng)格重鏈蛋白的結(jié)構(gòu)
        3.1.3 網(wǎng)格重鏈蛋白進(jìn)化分析
    3.2 百脈根網(wǎng)格重鏈蛋白與ROP6 相互作用
        3.2.1 百脈根CHC2 與ROP6 相互作用結(jié)構(gòu)域分析
        3.2.2 百脈根CHC2 與ROP6 體外相互作用
        3.2.3 CHC2 與ROP6 在煙草細(xì)胞相互作用
        3.2.4 百脈根CHC2 與ROP6 相互作用的特異性
            3.2.4.1 百脈根ROP6 與CHC2 特異性相互作用
            3.2.4.2 百脈根CHC2 與ROP6 特異性相互作用
    3.3 百脈根網(wǎng)格重鏈蛋白與CLCs相互作用
        3.3.1 百脈根CHC2 與CLCs相互作用
        3.3.2 百脈根CHC2 與CLC1 在煙草細(xì)胞相互作用
        3.3.3 CLC1 的磷酸化不影響與CHC2 的體外相互作用
            3.3.3.1 CLC1 在大腸桿菌細(xì)胞中被磷酸化
            3.3.3.2 CLC1 是否磷酸化在體外不影響與CHC2 相互作用
    3.4 百脈根CLC1 能競爭ROP6 與CHC2 的相互作用
    3.5 百脈根網(wǎng)格重鏈蛋白時(shí)空表達(dá)分析
        3.5.1 網(wǎng)格重鏈蛋白組織特異性表達(dá)分析
        3.5.2 網(wǎng)格重鏈蛋白在共生早期表達(dá)分析
        3.5.3 網(wǎng)格重鏈蛋白在根瘤中的表達(dá)分析
    3.6 CHC2 的RNAi影響結(jié)瘤數(shù)量
    3.7 CHC2 在百脈根根毛中的定位
        3.7.1 CHC2 在根毛中的定位
        3.7.2 CHC2 與NFR5 共定位
    3.8 總結(jié)
4 討論與展望
    4.1 討論
        4.1.1 CHC2 介導(dǎo)受體內(nèi)吞參與結(jié)瘤因子信號(hào)傳遞
        4.1.2 ROP6 可能調(diào)節(jié)CHC2 的內(nèi)吞間接參與結(jié)瘤因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)
        4.1.3 磷酸化影響網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的受體內(nèi)吞
    4.2 展望
參考文獻(xiàn)
附錄 1
附錄 2
附錄 3
附錄 4
致謝



本文編號(hào)：3171671