大量和無節(jié)制地使用化石燃料使得大氣中CO₂濃度不斷升高,產生溫室效應并使全球氣候變暖,給全球環(huán)境帶來了嚴重的破壞。另外,由于化石燃料的不可再生性,在不久的將來能源危機必然會成為現(xiàn)實。利用生物技術來改變當今由化石燃料和化學工業(yè)所主導的世界發(fā)展格局具有重要的意義,特別是利用以微藻為首的微生物來解決能源問題具有非常大的潛力和可行性。本文以能夠自養(yǎng)和異養(yǎng)生長的原殼小球藻為出發(fā)藻,以獲得高油脂含量和產率的異養(yǎng)培養(yǎng)過程為研究目標,從藻種的篩選到培養(yǎng)過程的優(yōu)化進行了系統(tǒng)性研究,并對鹽脅迫下胞內油脂過量積累的機理進行了深入的分析。首先,基于低場核磁共振技術,建立了原殼小球藻胞內油脂快速定量的方法。結果表明低場核磁共振信號與原殼小球藻細胞中的油脂量具有顯著的線性相關性,信號校正中線性回歸相關系數R²達到0.99以上,且油脂定量結果與標準的GC-MS法所測得結果偏差小于2%,結果的相對標準偏差也在2%以內。此外,該技術還能夠用于微藻培養(yǎng)液中胞內油脂快速、直接和無損的定量中,并成功地實現(xiàn)了原殼小球藻異養(yǎng)培養(yǎng)過程中油脂濃度實時和動態(tài)的監(jiān)測,對于過程優(yōu)化有重要的應用價... 

【文章來源】：華東理工大學上海市 211工程院校 教育部直屬院校

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【學位級別】：博士

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摘要
Abstract
第1章 緒論
    1.1 生物能源概述
        1.1.1 全球能源現(xiàn)狀
        1.1.2 生物能源地位
        1.1.3 生物柴油性質及用途
        1.1.4 生物柴油原料來源
    1.2 微藻生物能源研究概況
        1.2.1 微藻能源研究內容
        1.2.2 微藻的培養(yǎng)模式
        1.2.3 可進行產油異養(yǎng)培養(yǎng)的微藻
    1.3 優(yōu)良藻種的選育
        1.3.1 藻種的改造
            1.3.1.1 誘變育種
            1.3.1.2 基因工程改造
        1.3.2 油脂的測定方法
        1.3.3 藻種的高通量篩選
    1.4 微藻產油的代謝研究
        1.4.1 微藻中油脂的合成途徑
            1.4.1.1 脂肪酸的合成
            1.4.1.2 TAG的生物合成
        1.4.2 影響TAG積累和脂肪酸組成的因素
        1.4.3 TAG積累的生理作用
        1.4.4 脅迫條件下細胞的生理和生化響應
            1.4.4.1 脅迫條件下細胞響應的概述
            1.4.4.2 ROS的產生及其生理作用
    1.5 微藻異養(yǎng)產油培養(yǎng)過程優(yōu)化研究
        1.5.1 培養(yǎng)基優(yōu)化
        1.5.2 培養(yǎng)過程優(yōu)化
        1.5.3 過程氧代謝研究
        1.5.4 基于生理參數的過程優(yōu)化技術
    1.6 組學技術在微藻能源中的應用
        1.6.1 系統(tǒng)生物學研究概況
        1.6.2 組學技術在微藻能源中的應用進展
    1.7 本課題的研究內容與意義
第2章 材料和方法
    2.1 實驗材料
        2.1.1 藻種
        2.1.2 常用試劑
        2.1.3 主要儀器
        2.1.4 培養(yǎng)基
            2.1.4.1 常用培養(yǎng)基
            2.1.4.2 異養(yǎng)補料培養(yǎng)基
    2.2 培養(yǎng)方法
        2.2.1 自養(yǎng)培養(yǎng)
            2.2.1.1 自養(yǎng)種子保存
            2.2.1.2 自養(yǎng)種子培養(yǎng)
        2.2.2 異養(yǎng)培養(yǎng)
            2.2.2.1 異養(yǎng)種子培養(yǎng)
            2.2.2.2 異養(yǎng)孔板培養(yǎng)
            2.2.2.3 異養(yǎng)搖瓶培養(yǎng)
            2.2.2.4 異養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)
    2.3 常規(guī)分析測定方法
        2.3.1 生物量的測定
        2.3.2 比生長速率的計算
        2.3.3 葡萄糖濃度測定
        2.3.4 細胞中多糖含量測定
        2.3.5 細胞中總蛋白濃度的測定
        2.3.6 細胞中粗脂含量測定
        2.3.7 脂肪酸含量的測定
        2.3.8 氮濃度測定
        2.3.9 磷濃度的測定
        2.3.10 葉綠素濃度的測定
        2.3.11 培養(yǎng)基中滲透壓的測定
        2.3.12 pH,DO的測定
第3章 低場核磁共振技術在微藻油脂測定中的應用
    3.1 引言
    3.2 材料和方法
        3.2.1 低場核磁共振技術油脂測定條件和參數
        3.2.2 MnCl_2添加濃度的優(yōu)化
        3.2.3 油脂樣品的測定
        3.2.4 原殼小球藻的異養(yǎng)培養(yǎng)
        3.2.5 基于低場核磁共振技術的油脂在線監(jiān)測
        3.2.6 數據統(tǒng)計分析
    3.3 結果和討論
        3.3.1 低場核磁共振技術測定微藻油脂
        3.3.2 自由水信號的排除和MnCl_2添加濃度的優(yōu)化
        3.3.3 低場核磁共振信號的校正
        3.3.4 測定方法的準確性和精確性分析
        3.3.5 微藻培養(yǎng)過程中油脂在線監(jiān)測的應用
    3.4 本章小結
第4章 高產油藻種的篩選和培養(yǎng)基優(yōu)化
    4.1 前言
    4.2 材料和方法
        4.2.1 藻種的誘變育種
            4.2.1.1 尼羅紅熒光染料法油脂測定
            4.2.1.2 誘變方法
            4.2.1.3 篩選方法
            4.2.1.4 高產油藻種的放大培養(yǎng)
            4.2.1.5 數據統(tǒng)計及分析
        4.2.2 異養(yǎng)培養(yǎng)基優(yōu)化
            4.2.2.1 不同磷酸鹽濃度培養(yǎng)實驗
            4.2.2.2 不同葡萄糖和硝酸鈉濃度培養(yǎng)實驗
            4.2.2.3 胞內磷含量的測定
    4.3 結果和討論
        4.3.1 高產油藻種的篩選
            4.3.1.1 不同誘變方法的致死率
            4.3.1.2 藻種誘變及篩選
            4.3.1.3 高產油藻種的驗證
        4.3.2 異養(yǎng)培養(yǎng)基的優(yōu)化
            4.3.2.1 磷源對生長和產油的影響
            4.3.2.2 碳源和氮源對生長和產油的影響
    4.4 本章小結
第5章 基于過程在線監(jiān)測的原殼小球藻產油培養(yǎng)過程優(yōu)化
    5.1 前言
    5.2 材料和方法
        5.2.1 異養(yǎng)培養(yǎng)
        5.2.2 異養(yǎng)中細胞呼吸生理參數OUR、CER及RQ的測定
        5.2.3 自養(yǎng)及雙模式培養(yǎng)
        5.2.4 數據統(tǒng)計分析
    5.3 結果和討論
        5.3.1 異養(yǎng)培養(yǎng)中宏觀氧代謝研究和基于過程在線監(jiān)測的培養(yǎng)工藝優(yōu)化
        5.3.2 異養(yǎng)培養(yǎng)中不同供氧對細胞生長和油脂積累的影響
        5.3.3 異養(yǎng)培養(yǎng)中氮限制對細胞生長和油脂積累的影響
        5.3.4 兩階段氧供應和氮限制策略促進油脂的積累和轉化
        5.3.5 兩階段補料分批培養(yǎng)策略進一步提高油脂的產率
        5.3.6 新型雙模式培養(yǎng)降低CO_2的釋放并提高油脂產率
    5.4 本章小結
第6章 鹽脅迫促進異養(yǎng)原殼小球藻細胞中油脂的積累
    6.1 前言
    6.2 材料和方法
        6.2.1 鹽和滲透壓脅迫培養(yǎng)實驗
        6.2.2 胞內ROS,丙二醛(MDA)和酶活的測定
        6.2.3 掃描電子顯微鏡(SEM)的觀察
        6.2.4 數據統(tǒng)計分析
    6.3 結果和討論
        6.3.1 不同NaCl濃度對生長和油脂積累的作用
        6.3.2 NaCl脅迫對細胞氧化應激的影響
        6.3.3 NaCl脅迫對胞內代謝途徑中關鍵酶活性的影響
        6.3.4 NaCl脅迫對脂肪酸組分和細胞形態(tài)的影響
        6.3.5 鹽脅迫和滲透壓脅迫效果的比較分析
        6.3.6 鹽脅迫條件下油脂積累機制的總結
    6.4 本章小結
第7章 原殼小球藻異養(yǎng)過程鹽脅迫下油脂積累的轉錄組學研究
    7.1 前言
    7.2 材料和方法
        7.2.1 異養(yǎng)鹽脅迫實驗和樣品準備
        7.2.2 樣品的準備
        7.2.3 RNA的提取
        7.2.4 轉錄組測序和分析
        7.2.5 胞內代謝物分析
    7.3 結果和討論
        7.3.1 原殼小球藻在5L反應器中異養(yǎng)鹽脅迫培養(yǎng)
        7.3.2 原殼小球藻De novo轉錄組測序結果
        7.3.3 差異表達基因的聚類和功能分析
        7.3.4 鹽脅迫前后與氧化應激相關基因表達分析
        7.3.5 油脂合成途徑及胞內代謝物的分析
        7.3.6 基于多水平分析的油脂積累機制總結
    7.4 本章小結
第8章 結論與展望
    8.1 結論
    8.2 創(chuàng)新點
    8.3 展望
參考文獻
致謝
攻讀博士期間撰寫的論文和專利



本文編號：3165192