本文關鍵詞：犬Ⅲ型干擾素的功能特點及B型流感病毒NEP蛋白出核功能研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：在本研究中,首次對犬Ⅲ型干擾素的功能進行了詳細的研究�；诤怂嵝蛄械南到y進化分析表明,該犬Ⅲ型干擾素與豬IFN-λ1,蝙蝠IFN-λ1和人IFN-λ1自然的聚為一支,表明該犬Ⅲ型干擾素為IFN-λ1。將該IFN-λ1于大腸桿菌中進行了表達,純化,并對純化后的蛋白進行了功能研究。結果表明,該IFN-λ1在同種和異種細胞上均具有一定的抗病毒活性,包括VSV病毒、犬細小病毒和H1N1流感病毒等。研究還發(fā)現犬IFN-λ1在CMT腫瘤細胞和MDCK細胞上均具有抗增殖活性,且在CMT腫瘤細胞上的抗增殖活性更強。此外,犬IFN-λ1可以激活JAK-STAT信號傳導系統。為了驗證該犬IFN-λ1是否能誘導干擾素誘導基因的表達,我們還用實時熒光定量PCR的方法檢測了犬IFN-λ1刺激MDCK細胞后的ISG15,Mx1和2'5'-OAS表達水平,結果表明,該三種干擾素誘導基因均被顯著上調。我們還用同樣的方法檢測了VSV和流感病毒感染后的MDCK細胞中的IFN-λ1的mRNA水平,結果顯示,與對照相比,IFN-λ1的mRNA水平也明顯被上調。最后,本研究還通過ELISA的方法進行了犬IFN-λ1與其受體胞外域(IFNλR1-EC)的結合檢測,結果顯示,犬IFN-λ1能很好的與IFNλR1-EC進行結合。流感病毒的核輸出蛋白(NEP蛋白)是病毒粒子中的結構蛋白,由病毒的第八個基因片段編碼產生,在病毒的基因組復制與轉錄,病毒vRNP復合物的細胞核輸出過程、病毒粒子的組裝、出芽等多個環(huán)節(jié)發(fā)揮著重要作用。目前對B型流感病毒NEP蛋白核穿梭機制的研究還存在很多尚未解決的問題。本研究以BNEP為研究對象,發(fā)現了B型流感病毒NEP蛋白上存在三個NES,且都是CRM1依賴的。這三個NES在體內可與CRMl直接結合。這三個NES上的疏水性氨基酸對其功能的發(fā)揮都是至關重要的,三個NES共同介導了蛋白的出核。
【關鍵詞】：犬 干擾素λ 干擾素α 抗病毒活性 抗增殖活性 干擾素誘導基因 B型流感病毒 NEP蛋白 NES出核信號 CRM1蛋白
【學位授予單位】：廣西大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S852.65
【目錄】：

• 摘要4-5
• ABSTRACT5-10
• 第一章 文獻綜述10-48
• 1.1 干擾素的發(fā)現及命名10
• 1.2 干擾素的分類10-13
• 1.2.1 Ⅰ型干擾素10-12
• 1.2.2 Ⅱ型干擾素12-13
• 1.2.3 Ⅲ型干擾素13
• 1.3 干擾素的空間結構13-16
• 1.4 干擾素的受體16-18
• 1.5 干擾素的產生途徑18-24
• 1.5.1 TLR受體介導的干擾素產生途徑19-22
• 1.5.2 RLR介導的干擾素產生途徑22-24
• 1.6 干擾素的下游信號通路24-26
• 1.7 干擾素誘導基因26-31
• 1.7.1 ISG1526-28
• 1.7.2 蛋白激酶PKR28-29
• 1.7.3 寡腺苷酸合成酶OAS29-30
• 1.7.4 Mx GTPase30-31
• 1.8 干擾素的表達調控31-32
• 1.9 犬干擾素研究進展32-33
• 1.10 流感病毒的研究進展33-38
• 1.10.1 流感病毒的結構組成34-35
• 1.10.2 流感病毒的復制周期35-36
• 1.10.3 流感病毒的入侵36
• 1.10.4 vRNP的入核36
• 1.10.5 病毒基因組的轉錄和復制36-37
• 1.10.6 病毒vRNP的出核37
• 1.10.7 流感病毒的包裝和出芽37-38
• 1.11 蛋白質的核質轉運38-42
• 1.11.1 Ran依賴性的蛋白質核質轉運38-41
• 1.11.2 CRM1依賴性的蛋白出核41-42
• 1.12 流感病毒蛋白的核質運輸42-43
• 1.12.1 流感病毒vRNP及新合成的蛋白的入核42-43
• 1.12.2 新組裝的vRNP的出核43
• 1.13 流感病毒NEP蛋白的研究進展43-48
• 1.13.1 NEP蛋白的結構組成44-45
• 1.13.2 NEP蛋白在流感病毒vRNP出核過程中的作用45-46
• 1.13.3 NEP蛋白在流感病毒轉錄及復制過程中的作用46-48
• 第二章 犬Ⅲ型干擾素的分子特征及功能研究48-76
• 2.1 引言48
• 2.2 材料與方法48-51
• 2.2.1 主要化學試劑及實驗材料48-49
• 2.2.2 工具酶和試劑盒49
• 2.2.3 主要儀器49-50
• 2.2.4 菌株50
• 2.2.5 質粒50
• 2.2.6 毒株和細胞50
• 2.2.7 引物序列50-51
• 2.3 實驗方法51-61
• 2.3.1 質粒的構建51-53
• 2.3.2 蛋白質的表達與純化53-54
• 2.3.3 測定蛋白質濃度54-55
• 2.3.4 western blot免疫印跡分析55
• 2.3.5 干擾素活性測定55-57
• 2.3.6 病毒感染實驗57
• 2.3.7 RNA的提取57-58
• 2.3.8 mRNA的反轉錄58
• 2.3.9 Real-time PCR58-59
• 2.3.10 ELISA59
• 2.3.11 Luciferase實驗59-60
• 2.3.12 噬班實驗60
• 2.3.13 抗增殖實驗60-61
• 2.4 實驗結果61-73
• 2.4.1 系統進化分析揭示本研究中發(fā)現的犬IFN-λ為IFN-λ161-64
• 2.4.2 犬的IFN-λ、IFN-α7和IFN-λR1-EC的表達及純化64-65
• 2.4.3 犬IFN-λ,與犬IFN-α7的抗病毒活性比較65-66
• 2.4.4 犬IFN-λ激活JAK-STAT信號通路66-67
• 2.4.5 犬IFN-λ具有抗犬腫瘤細胞A72和MDCK細胞增殖的作用67-68
• 2.4.6 不同病毒感染MDCK細胞后引起的干擾素的mRNA的變化68-70
• 2.4.7 犬IFN-λ和IFN-α7刺激MDCK細胞對干擾素誘導基因的影響70-72
• 2.4.8 干擾素誘導基因表達對犬IFN-λ和IFN-α7具有劑量依賴性72
• 2.4.9 犬IFN-λ與其IFN-λR1受體胞外部分(IFN-λR1-EC)的結合能力測定72-73
• 2.5 討論73-76
• 第三章 流感病毒感染及CypA對Ⅰ型和Ⅲ型干擾素的轉錄水平影響的研究76-87
• 3.1 引言76-77
• 3.2 材料與方法77-80
• 3.2.1 細胞77
• 3.2.2 病毒77
• 3.2.3 病毒感染實驗77-78
• 3.2.4 RNA的提取78
• 3.2.5 反轉錄78
• 3.2.6 Real-time PCR78-79
• 3.2.7 Western blot免疫印跡分析79-80
• 3.3 實驗結果80-86
• 3.3.1 敲低CypA基因細胞系的驗證80-81
• 3.3.2 H1N1-WSN感染不同細胞系對干擾素的影響81-82
• 3.3.3 H1N1-PR8感染不同細胞系的干擾素變化情況82-83
• 3.3.4 H1N1-CA04感染不同細胞系的干擾素變化情況83-85
• 3.3.5 3株流感病毒感染不同細胞系后單一種類干擾素表達的比較85-86
• 3.4 討論86-87
• 第四章 B型流感病毒NEP蛋白上NES的研究87-99
• 4.1 引言87
• 4.2 材料與方法87-90
• 4.2.1 實驗材料87-88
• 4.2.2 實驗方法88-90
• 4.3 實驗結果90-97
• 4.3.1 對BNEP上NES的序列分析90-91
• 4.3.2 對BNEP上可能的NES的功能鑒定91-92
• 4.3.3 LMB抑制出核實驗鑒定BNEP上三個NES的CRM1依賴性92-93
• 4.3.4 BNEP上三個NES與CRM1的體內結合研究93-94
• 4.3.5 NES中疏水性氨基酸對NES出核功能的影響94-96
• 4.3.6 BNEP蛋白的3個NES對定位的影響96-97
• 4.3.7 BNEP蛋白上的3個NES對B型流感病毒復制的影響97
• 4.4 討論97-99
• 第五章 結論與創(chuàng)新點99-100
• 參考文獻100-112
• 博士期間發(fā)表文章及專利112-113
• 致謝113

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