本文關(guān)鍵詞：大腸桿菌二肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白YbgH結(jié)構(gòu)與功能研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：在生命活動(dòng)過(guò)程中,細(xì)胞需要在環(huán)境中攝取營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),并且要把新陳代謝過(guò)程中產(chǎn)生的廢物外排出去。這些都需要定位在細(xì)胞膜上的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白來(lái)完成。主動(dòng)運(yùn)輸是指利用外來(lái)能量進(jìn)行的底物跨膜運(yùn)輸,而底物的運(yùn)動(dòng)方向往往與自身濃度梯度相反,也就是將物質(zhì)從低濃度一側(cè)運(yùn)輸?shù)礁邼舛纫粋?cè)。根據(jù)能量來(lái)源的不同,膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白主要?jiǎng)澐譃槌跫?jí)主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和次級(jí)主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。MFS超家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是最大的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族之一,屬于次級(jí)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。該家族成員主要利用膜兩側(cè)的質(zhì)子、鈉離子濃度梯度作為驅(qū)動(dòng)力,將底物進(jìn)行跨膜運(yùn)輸。EcYbgH是大腸桿菌中利用細(xì)胞膜兩側(cè)質(zhì)子濃度梯度轉(zhuǎn)運(yùn)小肽的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。其主要底物是C端具有攜帶正電荷的氨基酸殘基的小肽。 我們解析了EcYbgH處于內(nèi)向型構(gòu)象的3.4A分辨率晶體結(jié)構(gòu),并利用細(xì)胞水平的轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)研究了該蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)功能。在結(jié)構(gòu)分析中,我們發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞膜外側(cè)在穿膜螺旋5-6之間的A類模體和保守的Asp44-Arg297鹽橋,對(duì)于穩(wěn)定內(nèi)向型構(gòu)象是非常關(guān)鍵的,而細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)TM2/3之間的模體A則可以將蛋白穩(wěn)定在外向型構(gòu)象。這三個(gè)相互作用均發(fā)生于轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的兩個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域之間。當(dāng)破壞三者中的一個(gè)或者兩個(gè),EcYbgH蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)活性就會(huì)喪失。而當(dāng)把三者同時(shí)破壞,轉(zhuǎn)運(yùn)活性又得到恢復(fù)。因此,我們認(rèn)為在MFS超家族蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中,存在一個(gè)內(nèi)向型與外向型構(gòu)象之間的能量平衡。而兩者的失衡不利于轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)活性。同時(shí),通過(guò)功能實(shí)驗(yàn)我們證明保守的Glu21是EcYbgH轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的質(zhì)子化位點(diǎn)。另外,原核POTs轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白亞家族成員氨基酸序列所特有的兩根“嵌入”跨膜螺旋可能參與了對(duì)構(gòu)象變化的調(diào)控。 除了對(duì)大腸桿菌二肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白YbgH進(jìn)行了結(jié)構(gòu)與功能的研究之外,我還參與了其它幾個(gè)膜蛋白的工作包括YajR、CsgG、PgpB等,在這些工作中我主要負(fù)責(zé)數(shù)據(jù)處理、結(jié)構(gòu)解析、修正以及分析。在處理這些工作的過(guò)程中,遇到了各種各樣的困難,例如數(shù)據(jù)分辨率低,晶體衍射各向異性等。對(duì)于各向異性的數(shù)據(jù),在數(shù)據(jù)處理的過(guò)程中一般使用ADS的軟件包,將數(shù)據(jù)進(jìn)行橢球形的截取,這樣就可以去掉信噪比不高的數(shù)據(jù)。在修正的過(guò)程中,通常采用各種約束來(lái)保證修正過(guò)程的穩(wěn)定,這些約束主要有二級(jí)結(jié)構(gòu)約束、二面角約束、參考模型約束等。
【關(guān)鍵詞】：次級(jí)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 EcYbgH 模體A 能量平衡 質(zhì)子化位點(diǎn) 嵌入螺旋
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：Q936
【目錄】：

• 摘要5-6
• Abstract6-12
• 第1章 引言12-26
• 1.1 膜蛋白概述12-13
• 1.2 膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白13-15
• 1.2.1 被動(dòng)運(yùn)輸13-14
• 1.2.2 主動(dòng)運(yùn)輸14-15
• 1.3 MFS家族研究現(xiàn)狀15-19
• 1.3.1 MFS超家族蛋白分類15-16
• 1.3.2 MFS超家族結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究16-18
• 1.3.3 MFS超家族轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制18-19
• 1.4 POT家族研究背景19-26
• 1.4.1 POTs家族保守motif19-20
• 1.4.2 人源POTs家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,PepT1和PepT220-21
• 1.4.3 POTs家族結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究21-22
• 1.4.4 大腸桿菌YbgH(EcYbgH)研究背景22-26
• 第2章 膜蛋白的結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究26-42
• 2.1 膜蛋白表達(dá)26-27
• 2.2 去污劑27-30
• 2.2.1 去污劑的分類27-28
• 2.2.2 去污劑在溶液中的性質(zhì)28-29
• 2.2.3 去污劑在結(jié)構(gòu)生物學(xué)中的應(yīng)用29-30
• 2.3 晶體生長(zhǎng)30-33
• 2.3.1 膜蛋白晶體堆積方式30-31
• 2.3.2 結(jié)晶方法31-32
• 2.3.3 提高膜蛋白穩(wěn)定性32-33
• 2.4 重原子浸泡33-35
• 2.5 數(shù)據(jù)收集以及結(jié)構(gòu)修正35-39
• 2.5.1 同步輻射設(shè)施發(fā)展35-36
• 2.5.2 數(shù)據(jù)收集、處理36-38
• 2.5.3 模型搭建以及結(jié)構(gòu)修正策略38-39
• 2.6 展望39-42
• 第3章 實(shí)驗(yàn)原理與方法42-50
• 3.1 克隆構(gòu)建42-43
• 3.1.1 雙酶切構(gòu)建42
• 3.1.2 不依賴于連接酶的構(gòu)建42
• 3.1.3 點(diǎn)突變構(gòu)建42-43
• 3.2 大腸桿菌系統(tǒng)膜蛋白表達(dá)43-44
• 3.3 破菌、蛋白純化44-46
• 3.4 硒代晶體制備46-47
• 3.5 細(xì)胞水平的轉(zhuǎn)運(yùn)試驗(yàn)47
• 3.6 Western Blot檢測(cè)膜蛋白表達(dá)水平47-50
• 第4章 大腸桿菌YbgH的克隆、表達(dá)和結(jié)晶50-58
• 4.1 EcYbgH基本信息50
• 4.2 EcYbgH的克隆,表達(dá)以及純化條件摸索50-52
• 4.2.1 EcYbgH克隆、表達(dá)50-51
• 4.2.2 EcYbgH不同去污劑51-52
• 4.3 EcYbgH晶體篩選和優(yōu)化52-58
• 4.3.1 晶體初步篩選52-54
• 4.3.2 晶體優(yōu)化和重復(fù)54-55
• 4.3.3 重原子衍生物制備55-58
• 第5章 數(shù)據(jù)收集、結(jié)構(gòu)解析以及修正58-66
• 5.1 晶體數(shù)據(jù)收集58
• 5.2 相位解析58-61
• 5.3 模型搭建以及修正61-63
• 5.4 EcYbgH晶體結(jié)構(gòu)分析63-66
• 第6章 EcYbgH基于結(jié)構(gòu)的功能研究66-76
• 6.1 質(zhì)子化位點(diǎn)66-69
• 6.1.1 膜電位與轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白66
• 6.1.2 質(zhì)子化如何成為驅(qū)動(dòng)力66-67
• 6.1.3 EcYbgH質(zhì)子化位點(diǎn)67-69
• 6.2 Motif A69-73
• 6.2.1 Motif A的工作機(jī)制69-71
• 6.2.2 EcYbgH中的motif A71-73
• 6.3 V形插入螺旋73-75
• 6.3.1 motif A調(diào)控模型73-74
• 6.3.2 HAB的功能74-75
• 6.4 結(jié)論與展望75-76
• 第7章 CsgG結(jié)構(gòu)與功能研究76-86
• 7.1 細(xì)菌與Curli76-77
• 7.2 大腸桿菌Curli的研究77-78
• 7.3 CsgG的克隆、表達(dá)、純化以及長(zhǎng)晶體78-79
• 7.4 CsgG結(jié)構(gòu)解析及修正79-83
• 7.5 CsgG結(jié)構(gòu)分析83-85
• 7.6 CsgG的功能研究85-86
• 第8章 參與的其它工作86-91
• 8.1 EcYajR的結(jié)構(gòu)解析86-88
• 8.1.1 EcYajR研究背景86
• 8.1.2 EcYaJR結(jié)構(gòu)解析、修正以及分析86-87
• 8.1.3 YAM結(jié)構(gòu)域87-88
• 8.2 EcPgpB的結(jié)構(gòu)解析88-90
• 8.2.1 EcPgpB研究背景88-89
• 8.2.2 EcPgpB晶體結(jié)構(gòu)解析89-90
• 8.3 脂多糖合成相關(guān)復(fù)合物L(fēng)ptD/E90-91
• 參考文獻(xiàn)91-100
• 附錄1 實(shí)驗(yàn)儀器和材料100-102
• 附錄2 E.coli MFS超家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白motif A預(yù)測(cè)102-106
• 致謝106-108
• 在讀期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文108

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：307573