本文關(guān)鍵詞：Ⅱ型NADH脫氫酶NDH2的結(jié)構(gòu)與功能研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：由單亞基組成的II型NADH脫氫酶(簡稱為NDH2)是呼吸鏈上多亞基的復(fù)合物I(I型NADH脫氫酶,NDH-1,又稱為NADH:輔酶Q氧化還原酶)的可替代蛋白,兩者在線粒體電子傳遞鏈上參與催化電子從NADH傳遞到輔酶Q。酵母的NDH2(Ndi1)蛋白存在于線粒體基質(zhì)膜內(nèi)側(cè),對于維持線粒體NADH/NAD+的動(dòng)態(tài)平衡至關(guān)重要;它還可以用于由復(fù)合物I缺陷引起的人類疾病的基因治療中。此外,NDH2存在于低等生物中,尤其是在病原微生物中廣泛存在,并且在人體內(nèi)并無它的同源蛋白,因此,它是一種非常好的藥物靶點(diǎn)。通過蛋白質(zhì)體外表達(dá)、純化和X-射線晶體學(xué)的研究,我們解析了世界上第一個(gè)NDH2蛋白——Ndi1的2.39埃高分辨晶體結(jié)構(gòu),以及Ndi1與輔酶Q(2.48埃)、N ADH(2.26埃)和N ADH-輔酶Q(2.52埃)的底物復(fù)合物結(jié)構(gòu);在所有的結(jié)構(gòu)中,Ndi1都是同源二聚體。通過序列分析發(fā)現(xiàn),NDH2蛋白家族存在一個(gè)保守的C端結(jié)構(gòu)域,該結(jié)構(gòu)域在介導(dǎo)蛋白質(zhì)的二聚化、膜錨定以及底物的識別中發(fā)揮著重要作用;相關(guān)的生化和細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)也證明了這一觀點(diǎn)。通過解析Ndi1蛋白與底物結(jié)合的復(fù)合物結(jié)構(gòu),結(jié)合電子順磁共振實(shí)驗(yàn),我們對呼吸鏈上電子傳遞的機(jī)制有了更加深入的了解。由于NDH2蛋白存在于多種病原微生物中,是一個(gè)良好的藥物靶點(diǎn),我們還在體外摸索了7種其他物種NDH2的表達(dá)純化條件,并對其進(jìn)行了晶體學(xué)分析,以及分子化合物庫的篩選,最終得到了一些有良好抑制作用的化合物分子,這些工作將對于針對致病微生物的藥物開發(fā)和設(shè)計(jì)有很好的幫助。本文綜合使用X-射線晶體衍射方法、生物化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、藥物化學(xué)、物理學(xué)等多種手段,全面系統(tǒng)的研究了最具有代表性的酵母Ndi1的蛋白結(jié)構(gòu)、功能,以及其電子傳遞的可能機(jī)制。同時(shí),對于多種病原微生物N DH2蛋白的研究,不僅加強(qiáng)了我們對N DH2家族結(jié)構(gòu)的了解,也對后期抑制劑分子的篩選與優(yōu)化,以及藥物的設(shè)計(jì)提供理論依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：電子傳遞鏈 NDH2 藥物靶點(diǎn) 病原微生物
【學(xué)位授予單位】：清華大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：Q55
【目錄】：

• 摘要3-4
• Abstract4-9
• 主要符號對照表9-11
• 第1章 引言11-34
• 1.1 電子傳遞鏈11-13
• 1.1.1 真核生物的電子傳遞鏈11-12
• 1.1.2 原核生物的電子傳遞鏈12-13
• 1.2 N ADH脫氫酶及其分類13-15
• 1.2.1 復(fù)合物I13-14
• 1.2.2 N qr14
• 1.2.3 N DH214-15
• 1.3 N DH2的研究現(xiàn)狀15-18
• 1.3.1 N DH2的分類15-16
• 1.3.2 N DH2的生理意義16-17
• 1.3.3 N DH2蛋白結(jié)構(gòu)的研究17-18
• 1.4 酵母的N DH2蛋白——N di118-22
• 1.4.1 N di1作為基因治療手段18-20
• 1.4.2 N di1的酶反應(yīng)機(jī)制20-22
• 1.5 病原微生物與N DH222-24
• 1.6 肺結(jié)核及結(jié)核分枝桿菌24-29
• 1.6.1 肺結(jié)核現(xiàn)狀24-27
• 1.6.2 結(jié)核分枝桿菌27
• 1.6.3 抗結(jié)核藥物及其靶點(diǎn)27-29
• 1.7 結(jié)核分枝桿菌呼吸鏈及其N DH229-33
• 1.7.1 結(jié)核分枝桿菌的呼吸鏈29-30
• 1.7.2 Mtb N DH2是無氧條件下起始呼吸鏈的關(guān)鍵蛋白30-31
• 1.7.3 Mtb N DH2與異煙肼和乙醇胺耐受有關(guān)31-32
• 1.7.4 Mtb N DH2抑制劑有抗TB作用32-33
• 1.8 潛在藥物靶點(diǎn)—— N DH233-34
• 第2章 實(shí)驗(yàn)材料與方法34-58
• 2.1 實(shí)驗(yàn)儀器34-36
• 2.2 實(shí)驗(yàn)試劑36-43
• 2.2.1 實(shí)驗(yàn)用菌株36-37
• 2.2.2 基因及菌株獲取途徑37
• 2.2.3 表達(dá)載體的選擇37-38
• 2.2.4 實(shí)驗(yàn)常用培基38-41
• 2.2.5 常用儲(chǔ)液及緩沖液41-43
• 2.2.6 常用試劑盒43
• 2.3 實(shí)驗(yàn)方法43-58
• 2.3.1 分子克隆43-46
• 2.3.2 蛋白表達(dá)46-47
• 2.3.3 蛋白純化47-50
• 2.3.4 蛋白結(jié)晶及優(yōu)化50-52
• 2.3.5 蛋白與底物復(fù)合物的結(jié)晶52
• 2.3.6 數(shù)據(jù)收集及相位問題52-54
• 2.3.7 酶活測定54-55
• 2.3.8 酵母實(shí)驗(yàn)55-56
• 2.3.9 電子順磁共振實(shí)驗(yàn)56-57
• 2.3.10結(jié)核分枝桿菌生長抑制實(shí)驗(yàn)57-58
• 第3章 酵母Ndi1蛋白的純化及結(jié)晶58-76
• 3.1 本章引論58
• 3.2 蛋白的基本信息分析58-60
• 3.3 蛋白的表達(dá)純化60-65
• 3.3.1 克隆構(gòu)建60
• 3.3.2 蛋白的表達(dá)60-61
• 3.3.3 蛋白的純化61-63
• 3.3.4 突變體蛋白的純化63-65
• 3.4 N di1蛋白晶體的篩選及優(yōu)化65-73
• 3.4.1 晶體的初篩選嘗試66-67
• 3.4.2 基于TritonX- 100分子的晶體篩選67-69
• 3.4.3 N di1蛋白晶體的優(yōu)化69-72
• 3.4.4 N di1硒代蛋白晶體72
• 3.4.5 N di1蛋白與底物的復(fù)合物晶體72-73
• 3.5 衍射數(shù)據(jù)的收集和處理73-75
• 3.6 小結(jié)75-76
• 第4章 酵母Ndi1蛋白的結(jié)構(gòu)與生化研究76-99
• 4.1 本章引論76
• 4.2 N di1蛋白的晶體結(jié)構(gòu)76-92
• 4.2.1 N di1蛋白的整體結(jié)構(gòu)76-78
• 4.2.2 TritonX- 100在蛋白中的結(jié)合位置78
• 4.2.3 高度保守的C端結(jié)構(gòu)域78-79
• 4.2.4 C端結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)N di1蛋白的二聚化79-83
• 4.2.5 C端結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)N di1蛋白的膜錨定83-86
• 4.2.6 N di1蛋白及其底物86-92
• 4.3 N di1蛋白的電子傳遞機(jī)制92-98
• 4.3.1 N di1-N ADH-Q的復(fù)合物結(jié)構(gòu)93-94
• 4.3.2 與Pdr- Pdx復(fù)合物的結(jié)構(gòu)比對94-95
• 4.3.3 N di1蛋白中可能的電子傳遞路徑95
• 4.3.4 電子順磁共振實(shí)驗(yàn)檢測半醌自由基95-96
• 4.3.5 功率飽和實(shí)驗(yàn)檢測存在兩種半醌自由基96-98
• 4.4 本章小結(jié)98-99
• 第5章 結(jié)核分枝桿菌及其他病原微生物NDH2的研究99-127
• 5.1 本章引論99
• 5.2 結(jié)核分枝桿菌N DH2的表達(dá)純化99-108
• 5.2.1 二級結(jié)構(gòu)預(yù)測及克隆構(gòu)建99-100
• 5.2.2 蛋白表達(dá)100-102
• 5.2.3 蛋白純化102-107
• 5.2.4 晶體的篩選107-108
• 5.3 體外藥物篩選108-113
• 5.3.1 體外檢測蛋白活性108-109
• 5.3.2 抑制劑篩選109-111
• 5.3.3 IC50檢測111
• 5.3.4 結(jié)核分枝桿菌生長抑制實(shí)驗(yàn)111-113
• 5.4 其他物種N DH2的研究113-125
• 5.4.1 恥垢分枝桿菌N DH2114-116
• 5.4.2 無乳鏈球菌N DH2116-119
• 5.4.3 惡性瘧原蟲N DH2119-122
• 5.4.4 其他物種N DH2122-125
• 5.5 小結(jié)125-127
• 第6章 討論與展望127-137
• 6.1 本章引論127
• 6.2 酵母N di1蛋白127-131
• 6.2.1 C端結(jié)構(gòu)域127-129
• 6.2.2 N di1蛋白的電子傳遞129-131
• 6.3 Mtb等病原微生物N DH2蛋白的研究131-132
• 6.3.1 M.sm eg與Mtb N DH2蛋白131-132
• 6.3.2 其他病原微生物的N DH2蛋白132
• 6.4 展望132-137
• 6.4.1 N di1蛋白存在的問題133-134
• 6.4.2 病原微生物N DH2蛋白的結(jié)構(gòu)134-135
• 6.4.3 病原微生物N DH2蛋白抑制劑的篩選與優(yōu)化135-136
• 6.4.4 抑制劑的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)136-137
• 參考文獻(xiàn)137-148
• 致謝148-151
• 個(gè)人簡歷、在學(xué)期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文與研究成果151

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8 朱u嚾

本文編號：306994