本文關(guān)鍵詞：HBx與COXIII共定位上調(diào)HepG2細(xì)胞線粒體功能促進(jìn)細(xì)胞增殖，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景和目的:乙肝病毒x蛋白(HBx)被稱為“病毒癌蛋白(viral oncoprotein)”,它促進(jìn)了乙型肝炎病毒(HBV)相關(guān)的肝細(xì)胞癌的發(fā)展,但其確切機(jī)制未明。我們前期通過酵母雙雜交、交配以及免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)首次證實(shí)了線粒體內(nèi)膜蛋白細(xì)胞色素C氧化酶亞單位III(COXIII)是HBx的體內(nèi)結(jié)合蛋白。本研究將進(jìn)一步探討HBx與COXIII在線粒體中共定位及其對線粒體超微結(jié)構(gòu)與功能的影響,探索HBx對HepG2細(xì)胞增殖能力的影響。方法:首先構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)HBx的肝癌細(xì)胞株HepG2/HBx,并以空載對照組HepG2/mock、空白對照組HepG2作為實(shí)驗(yàn)對照,利用激光共聚焦顯微鏡觀察HBx與COXIII在線粒體中的定位。接著通過RT-PCR與Western blot法檢測COXIII的mRNA與蛋白表達(dá)水平,酶動力學(xué)方法檢測線粒體細(xì)胞色素C氧化酶(COX)的活性,流式細(xì)胞儀測量細(xì)胞內(nèi)ROS和線粒體跨膜電位的水平,掃描電鏡下觀察HepG2/HBx細(xì)胞線粒體超微結(jié)構(gòu)的改變。然后利用RT-PCR與Western blot法檢測環(huán)氧合酶-2(COX-2)的mRNA與蛋白表達(dá)水平,加入ROS清除劑N-乙酰半胱氨酸(NAC)后再檢測COX-2的表達(dá)水平改變。采用CCK-8法和克隆形成試驗(yàn)檢測細(xì)胞的增殖能力,接著加入COX-2的抑制劑NS-398后再次檢測細(xì)胞的增殖能力改變情況。最后通過RT-PCR與Western blot法檢測β catenin的mRNA與蛋白表達(dá)水平,RT-PCR法檢測β catenin下游靶基因cyclin-D1以及c-myc的mRNA表達(dá)水平,并加入COX-2的抑制劑NS-398后觀察HepG2/HBx細(xì)胞株β catenin蛋白表達(dá)水平改變,再加入β catenin的抑制劑XAV939后CCK-8法檢測細(xì)胞增殖能力的改變。結(jié)果:成功構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)HBx的肝癌細(xì)胞株HepG2/HBx,激光共聚焦顯微鏡觀察到HBx與COXIII在線粒體中共定位。HBx上調(diào)HepG2細(xì)胞COXIII轉(zhuǎn)錄后水平,增高COX酶活性、ROS水平以及線粒體跨膜電位。掃描電鏡下觀察到HepG2/HBx細(xì)胞線粒體稍腫脹。另外,HBx上調(diào)HepG2細(xì)胞COX-2的mRNA與蛋白表達(dá)水平,當(dāng)加入ROS的清除劑NAC后,COX-2的蛋白表達(dá)水平下降。HepG2/HBx增殖能力增強(qiáng),克隆形成率增高,當(dāng)加入COX-2的抑制劑NS-398后,HepG2/HBx細(xì)胞的增殖能力下降。最后,我們檢測到HBx能夠上調(diào)HepG2細(xì)胞β catenin的mRNA與蛋白表達(dá)水平,以及β catenin下游靶基因cyclin-D1和c-myc的mRNA表達(dá)水平,加入COX-2的抑制劑NS-398后HepG2/HBx細(xì)胞株β catenin蛋白表達(dá)水平下調(diào),而當(dāng)加入β catenin的抑制劑XAV939后,HepG2/HBx細(xì)胞的增殖能力下降。結(jié)論:穩(wěn)定表達(dá)的HBx能夠與COXIII在HepG2細(xì)胞線粒體中共定位,上調(diào)線粒體的功能,增加ROS的水平來提高COX-2的表達(dá),進(jìn)一步上調(diào)β catenin的表達(dá)水平從而促進(jìn)細(xì)胞的增殖。
【關(guān)鍵詞】：乙肝病毒x蛋白 細(xì)胞色素C氧化酶亞單位III 活性氧 環(huán)氧合酶-2 細(xì)胞增殖
【學(xué)位授予單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R373.21
【目錄】：

• 縮略詞表4-5
• 中文摘要5-7
• 英文摘要7-9
• 前言9-13
• 第一部分 穩(wěn)定表達(dá)HBx的肝癌細(xì)胞株的構(gòu)建與鑒定13-25
• 一 引言13
• 二 實(shí)驗(yàn)材料與實(shí)驗(yàn)儀器13-14
• 三 實(shí)驗(yàn)步驟14-22
• 四 實(shí)驗(yàn)結(jié)果22-25
• 第二部分 HBx與COXIII在Hep G2 細(xì)胞中共定位及其對線粒體結(jié)構(gòu)與功能的影響25-40
• 一 引言25-26
• 二 實(shí)驗(yàn)材料與實(shí)驗(yàn)儀器26-27
• 三 實(shí)驗(yàn)步驟27-32
• 四 實(shí)驗(yàn)結(jié)果32-38
• 五 討論38-40
• 第三部分 HBx通過上調(diào)ROS水平增加COX-2 的表達(dá)促進(jìn)了Hep G2細(xì)胞的增殖40-58
• 一 引言40
• 二 實(shí)驗(yàn)材料與實(shí)驗(yàn)儀器40-42
• 三 實(shí)驗(yàn)步驟42-47
• 四 實(shí)驗(yàn)結(jié)果47-56
• 五 討論56-58
• 第四部分 HBx通過上調(diào)COX-2 水平激活β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路促進(jìn)了Hep G2 細(xì)胞的增殖58-73
• 一 引言58
• 二 實(shí)驗(yàn)材料與實(shí)驗(yàn)儀器58-59
• 三 實(shí)驗(yàn)步驟59-64
• 四 實(shí)驗(yàn)結(jié)果64-71
• 五 討論71-73
• 結(jié)論73-74
• 參考文獻(xiàn)74-82
• 綜述82-96
• 參考文獻(xiàn)89-96
• 致謝96

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 余桂芳;嚴(yán)躍紅;王瑞鑫;李顯波;曾文鋌;朱科倫;;慢病毒介導(dǎo)HBV X基因穩(wěn)定表達(dá)HepG2細(xì)胞系的建立[J];世界華人消化雜志;2012年08期

  本文關(guān)鍵詞：HBx與COXIII共定位上調(diào)HepG2細(xì)胞線粒體功能促進(jìn)細(xì)胞增殖，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：306803