本文關(guān)鍵詞：干酪乳桿菌和植物乳桿菌耐藥分子機(jī)制的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：本文研究了17株干酪乳桿菌和15株植物乳桿菌對11種抗生素的耐藥性,通過MIC值的測定并對20個相關(guān)抗性基因的檢測發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌對鏈霉素的耐藥性變化范圍較大,從16 μg/mL(?)512μg/mL,且植物乳桿菌IMAU60045和IMAU80091均攜帶有鏈霉素相關(guān)抗性基因aadA和ant(6),但對鏈霉素表現(xiàn)出不同的耐藥性,分別為16和256 μg/mL。將低抗鏈霉素耐藥性植物乳桿菌IMAU60045在含有鏈霉素濃度遞增的LSM培養(yǎng)基中連續(xù)傳代30天進(jìn)行高抗鏈霉素IMAU60045的構(gòu)建,IMAU60045的耐藥性由16μg/mL增加至16384μg/mL,耐藥性增加了1024倍。通過qPCR研究抗性基因aadA和ant(6)表達(dá)量的變化發(fā)現(xiàn)隨著傳代時間增加MAU60045中aadA和ant(6)的相對基因表達(dá)量逐漸增加,且傳代過程中前15天增加幅度高于后15天,傳代結(jié)束時高抗鏈霉素IMAU60045的aadA相對基因表達(dá)量是原始菌株的3.35倍,且比ant(6)的相對基因表達(dá)量增加快,傳代結(jié)束后aadA和ant(6)的相對基因表達(dá)量分別增加了0.702和0.337,說明長期受到含有鏈霉素的脅迫可引起與鏈霉素抗性相關(guān)基因相對表達(dá)量的增加。為深入研究乳桿菌的耐藥性及適應(yīng)性分子機(jī)制,以一株經(jīng)過系統(tǒng)研究的益生菌干酪乳桿菌Zhang為研究對象,采用實驗室進(jìn)化的研究方法將其接種至含有恒定濃度的單阿莫西林或慶大霉素及2者混合的LSM培養(yǎng)基中連續(xù)傳代2000代,并以不含抗生素的培養(yǎng)基傳代菌株作為對照,每隔200代取樣進(jìn)行基因組重測序,同時測定其耐藥性、活菌數(shù)和OD值的變化以分析干酪乳桿菌Zhang在傳代過程中表型和基因型的變化。通過該進(jìn)化實驗研究阿莫西林和慶大霉素對干酪乳桿菌Zhang的作用機(jī)制以及干酪乳桿菌Zhang對該2種抗生素耐藥性增加的機(jī)理。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn),在含有單一阿莫西林或慶大霉素及2者混合的LSM培養(yǎng)基中連續(xù)傳代的菌株耐藥性緩慢增加并分別在600、1200和1200代時開始保持恒定。同時,在植物乳桿菌IMAU60045和干酪乳桿菌Zhang的傳代研究中均發(fā)現(xiàn)了同類抗生素交叉耐藥性的現(xiàn)象,在鏈霉素培養(yǎng)基中傳代的IMAU60045和慶大霉素中傳代的干酪乳桿菌Zhang隨著傳代數(shù)增加,對其他氨基糖苷類抗生素的耐藥性均有不同程度增加,在阿莫西林培養(yǎng)基中傳代的干酪乳桿菌Zhang則對同屬β-內(nèi)酰胺類的氨芐西林表現(xiàn)出更高的耐藥性。通過對各代數(shù)不同培養(yǎng)基傳代的干酪乳桿菌Zhang的3個譜系基因突變(SNPs, InDels和SV)的檢測,發(fā)現(xiàn)阿莫西林和慶大霉素分別對干酪乳桿菌Zhang細(xì)胞壁合成與細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄和翻譯有較大的影響。本研究發(fā)現(xiàn)在LSM-A中傳代的菌株形態(tài)呈現(xiàn)長的細(xì)絲狀,且LSM-A中傳代菌株中檢測出與較大分子量青霉素結(jié)合蛋白相關(guān)的基因mrcA, pbpA, pbpB發(fā)生了突變。青霉素結(jié)合蛋白與細(xì)菌形態(tài)有直接聯(lián)系,并對細(xì)菌生長和繁殖有重要影響。在傳代過程中,由不同抗生素培養(yǎng)基中傳代的各譜系活菌數(shù)的變化可發(fā)現(xiàn),LSM-A中傳代的3個譜系活菌數(shù)始終保持相對較低的水平,而LSM-G中傳代的干酪乳桿菌Zhang則隨著傳代的進(jìn)行,活菌數(shù)和OD值都與對照菌株逐漸接近,說明不同抗生素對干酪乳桿菌Zhang的作用機(jī)制不同,使其在進(jìn)化過程中出現(xiàn)不同的適應(yīng)性�；蚪M重測序分析顯示,在不同培養(yǎng)基傳代的各代干酪乳桿菌Zhang基因組中檢測出抗生素鈍化酶、細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運蛋白、修復(fù)蛋白和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等與抗生素耐藥性相關(guān)的基因突變,這些基因突變對干酪乳桿菌Zhang改變抗生素作用靶位點、轉(zhuǎn)運并外排抗生素、改變細(xì)胞膜通透性、鈍化和改變抗生素結(jié)構(gòu)、調(diào)控抗藥基因的表達(dá)并維持正常能量代謝有重要的作用。本研究通過對干酪乳桿菌Zhang在恒定濃度的常見抗生素阿莫西林和慶大霉素培養(yǎng)基中連續(xù)傳代的實驗室進(jìn)化研究以及不同代數(shù)干酪乳桿菌Zhang各譜系基因組重測序的數(shù)據(jù)分析顯示,干酪乳桿菌Zhang在長期進(jìn)化過程中對阿莫西林和慶大霉素的耐藥性僅分別增加4倍和8倍,同時在更長時間的傳代進(jìn)化過程中保持恒定不變,不會出現(xiàn)與致病菌類似、耐藥性極強的“超級菌株”。本研究中檢測出的與干酪乳桿菌Zhang耐藥性增強的直接或間接相關(guān)的基因突變均未發(fā)生在轉(zhuǎn)座區(qū)域或者質(zhì)粒中,這也進(jìn)一步說明干酪乳桿菌Zhang是一株安全的益生菌。
【關(guān)鍵詞】：乳桿菌 最小抑制濃度 抗性基因 基因表達(dá) 進(jìn)化 全基因組重測序 耐藥機(jī)制
【學(xué)位授予單位】：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：Q93
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-15
• 縮略語表15-16
• 1 引言16-33
• 1.1 益生菌16-17
• 1.1.1 乳桿菌屬16-17
• 1.1.2 干酪乳桿菌Zhang17
• 1.2 抗生素17-30
• 1.2.1 抗生素的分類17-21
• 1.2.2 細(xì)菌耐藥性的出現(xiàn)21-22
• 1.2.3 細(xì)菌抗性基因的轉(zhuǎn)移22-23
• 1.2.4 乳酸菌耐藥性的研究23-27
• 1.2.5 乳酸菌耐藥性的檢測27-30
• 1.3 細(xì)菌進(jìn)化的研究30-32
• 1.3.1 細(xì)菌在含有抗生素環(huán)境中的進(jìn)化31-32
• 1.3.2 基因組重測序32
• 1.4 主要研究內(nèi)容及實驗?zāi)康暮鸵饬x32-33
• 2 材料與方法33-50
• 2.1 菌株來源33-34
• 2.2 主要試劑34
• 2.3 主要設(shè)備34-35
• 2.4 實驗方法35-50
• 2.4.1 干酪乳桿菌和植物乳桿菌耐藥性的研究35-39
• 2.4.2 干酪乳桿菌和植物乳桿菌抗性基因的檢測39-41
• 2.4.3 植物乳桿菌IMAU60045鏈霉素抗性基因的初步鑒定41-43
• 2.4.4 干酪乳桿菌Zhang在含有抗生素的培養(yǎng)基中連續(xù)傳代的研究43-49
• 2.4.5 數(shù)據(jù)分析49-50
• 3 結(jié)果與分析50-136
• 3.1 干酪乳桿菌和植物乳桿菌抗生素耐藥性50-55
• 3.2 干酪乳桿菌和植物乳桿菌抗性基因的檢測55-58
• 3.3 植物乳桿菌IMAU60045鏈霉素抗性基因的初步鑒定58-60
• 3.4 干酪乳桿菌Zhang在含有抗生素的培養(yǎng)基中的連續(xù)傳代60-68
• 3.4.1 干酪乳桿菌Zhang的生長曲線和代數(shù)計算60-62
• 3.4.2 干酪乳桿菌Zhang在抗生素環(huán)境中傳代過程中MIC的變化62-65
• 3.4.3 干酪乳桿菌Zhang在去抗生素選擇壓力培養(yǎng)基的傳代65
• 3.4.4 干酪乳桿菌Zhang對β-內(nèi)酰胺類和氨基糖苷類抗生素耐藥性的變化65-66
• 3.4.5 干酪乳桿菌Zhang在傳代過程中活菌數(shù)和OD值的變化66-68
• 3.5 干酪乳桿菌Zhang傳代過程中各譜系基因組重測序68-123
• 3.5.1 基因組重測序樣品DNA的質(zhì)量控制69-73
• 3.5.2 樣品純度的檢測73-77
• 3.5.3 干酪乳桿菌Zhang基因組重測序數(shù)據(jù)預(yù)處理77-86
• 3.5.4 各代不同傳代環(huán)境干酪乳桿菌Zhang基因組中基因突變檢測86-118
• 3.5.5 干酪乳桿菌Zhang質(zhì)粒中基因突變的檢測118
• 3.5.6 突變基因產(chǎn)物直系同源簇和代謝通路的分析118-123
• 3.6 干酪乳桿菌Zhang對阿莫西林和慶大霉素耐藥性增強機(jī)理的研究123-136
• 3.6.1 傳代過程中干酪乳桿菌Zhang對阿莫西林耐藥性增強機(jī)理研究124-132
• 3.6.2 傳代過程中干酪乳桿菌Zhang對慶大霉素耐藥性增強機(jī)理研究132-134
• 3.6.3 其他耐藥機(jī)理134-136
• 4 討論136-139
• 致謝139-140
• 參考文獻(xiàn)140-156
• 作者簡介156-157

【共引文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 陳小龍;胡永恒;周斌;;產(chǎn)nisin基因工程菌的構(gòu)建與應(yīng)用[J];發(fā)酵科技通訊;2015年03期

2 李宏波;趙立斌;;二元信號系統(tǒng)的研究進(jìn)展[J];河北醫(yī)藥;2015年08期

3 姚豐華;張鈺;朱國強;;沙門菌Ⅵ型分泌系統(tǒng)研究進(jìn)展[J];中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報;2014年06期

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 蔡霞;PhoP-PhoQ雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)調(diào)控福氏志賀菌毒力的機(jī)理研究[D];復(fù)旦大學(xué);2011年

2 姚豐華;腸炎沙門菌溶血素共調(diào)節(jié)蛋白hcp基因及其致病性相關(guān)研究[D];揚州大學(xué);2014年

3 陳臣;植物乳桿菌ST-Ⅲ全基因組序列分析及其對低聚果糖代謝通路的解析[D];江南大學(xué);2014年

  本文關(guān)鍵詞：干酪乳桿菌和植物乳桿菌耐藥分子機(jī)制的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：304200