本文關(guān)鍵詞：蛋白激酶OST1調(diào)控擬南芥響應(yīng)低溫脅迫的分子機制，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：生長在自然界中的植物經(jīng)常會受到低溫影響。作為主要的外界環(huán)境因子,低溫影響植物的生長、發(fā)育以及地理分布。經(jīng)過長期進(jìn)化,植物已經(jīng)擁有一套復(fù)雜而精細(xì)的機制抵抗低溫傷害。當(dāng)植物感受低溫信號以后,一系列冷響應(yīng)基因COR被激活,其編碼產(chǎn)物調(diào)節(jié)植物體內(nèi)的生理生化狀態(tài),從而增強植物對低溫的抵抗能力。目前,關(guān)于低溫信號的研究,較為清楚的是ICE1-CBF調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。在這個信號途徑中,低溫能迅速誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子CBFs基因的表達(dá),從而激活其下游靶基因COR的表達(dá),增強植物的抗凍能力。CBFs基因受到上游一些轉(zhuǎn)錄因子的直接調(diào)控,其中包括ICE1和CAMATA3等正調(diào)控因子。ICE1是CBFs上游關(guān)鍵的bHLH類轉(zhuǎn)錄因子,它受多種蛋白翻譯后修飾的調(diào)控。ICE1可以被E3泛素連接酶HOS1泛素化降解；同時還受到E3連接酶SIZ1蛋白的SUMO化穩(wěn)定。所以,ICEl蛋白翻譯后修飾是一個非常重要并且復(fù)雜的過程。蛋白磷酸化在植物生長發(fā)育及逆境應(yīng)答中發(fā)揮重要作用,而泛素化及SUMO化通常與磷酸化密切相關(guān),但在低溫信號中有關(guān)蛋白激酶的研究非常少,目前不清楚哪些蛋白激酶參與CBF信號途徑。 本論文通過篩選蛋白激酶突變體,獲得一個凍敏感突變體ost1(open stomatal1)。 OST1/SnRK2.6/SnRK2E是擬南芥中一類特異調(diào)節(jié)植物氣孔運動的Ser/Thr蛋白激酶,屬于SnRK2s蛋白激酶家族。在擬南芥中,SnRK2s共有10個成員(SnRK2.1-SnRK2.10)。SnRK2.6與SnRK2.2和SnRK2.3相似性最高,功能存在冗余。在ABA信號途徑中,OST1蛋白激酶活性受到PP2Cs蛋白磷酸酶的調(diào)控。在低濃度ABA條件下,PP2Cs通過與OST1相互作用抑制其活性；當(dāng)ABA達(dá)到一定濃度以后,ABA通過與其受體PCARs結(jié)合,結(jié)合ABA的受體構(gòu)象改變從而抑制PP2Cs活性,釋放OST1,激活狀態(tài)的OST1通過磷酸化轉(zhuǎn)錄因子AREBs/ABFs,從而激活A(yù)BA信號。另外,OST1可以磷酸化陰離子通道SLAC1,調(diào)節(jié)ABA介導(dǎo)的氣孔關(guān)閉。本論文發(fā)現(xiàn),ostl功能缺失突變體ostl-3和ostl-4均表現(xiàn)凍敏感表型,其體內(nèi)CBFs及其下游COR基因的本底水平及低溫誘導(dǎo)表達(dá)水平均低于野生型。過表達(dá)OST1能回復(fù)ostl突變體凍敏感表型。相反,OST1過表達(dá)株系則表現(xiàn)出明顯的抗凍表型,CBFs及其下游COR基因的本底水平及低溫誘導(dǎo)表達(dá)都明顯高于野生型。以上結(jié)果說明,OST1作用于CBFs上游,正調(diào)控植物的抗凍性。 有意思的是,低溫能夠快速(0.5h)激活植物體內(nèi)OST1蛋白激酶活性。在ABA合成缺陷突變體aba2-21中,OST1的激活程度與野生型類似。外源施加ABA合成抑制劑去甲二氫愈創(chuàng)木酸(nordihydroguaiaretic acid, NDGA)不能抑制aba2-21中低溫對OST1的激活。本論文還發(fā)現(xiàn),在OST1被低溫激活的時間范圍內(nèi),植物體內(nèi)ABA含量沒有增加,反而呈下降趨勢。這些結(jié)果暗示低溫對OST1的激活不依賴于ABA含量。在ABA信號中,OST1蛋白激酶活性受到PP2C蛋白磷酸酶ABI1/2等調(diào)控。本論文結(jié)果顯示,在abil-1(C)功能獲得型突變體中,低溫不能激活OST1。同時,abil-1(C)功能獲得型突變體和ABIl過表達(dá)植株均表現(xiàn)凍敏感表型,而abil abi2habl功能缺失突變體則表現(xiàn)抗凍表型。與之相一致的是,abil-1(C)功能獲得型突變體和ABIl過表達(dá)植株中的CBFs基因表達(dá)均低于野生型。這些結(jié)果說明,OST1激酶活性受低溫激活,ABl1通過抑制這一過程負(fù)調(diào)控植物的抗凍性。 通過酵母雙雜交的方法,本論文發(fā)現(xiàn)OST1與ICE1蛋白在酵母細(xì)胞中發(fā)生相互作用。Pull-down實驗驗證OST1與ICE1在體外發(fā)生直接相互作用。免疫共沉淀以及雙分子熒光互補實驗進(jìn)一步證明OST1與ICEI在植物體內(nèi)存在于同一個蛋白復(fù)合體中。進(jìn)一步實驗表明：激活狀態(tài)的OST1能夠磷酸化ICE1,從而增強ICE1的轉(zhuǎn)錄活性和蛋白穩(wěn)定性。低溫能增強ICE1蛋白體內(nèi)磷酸化的程度。在ost1突變體中,由低溫誘導(dǎo)的ICEI蛋白磷酸化程度減弱,說明低溫下ICE1蛋白的磷酸化主要由OST1蛋白介導(dǎo)。通過氨基酸序列和點突變分析發(fā)現(xiàn),OST1蛋白磷酸化ICE1蛋白的Ser278殘在。當(dāng)將ICE1蛋白Ser278突變成Asp278(模擬磷酸化形式,ICE1S278D)后,ICES278D的穩(wěn)定性明顯增強,同時ICES278D與HOS1蛋白的互作強度減弱。當(dāng)將ICE1的Ser278突變成Ala278(模擬非磷酸化形式,ICE1S278A)后轉(zhuǎn)入ice1-2突變體中，，ice1-22凍敏感表型不能被回復(fù)。這些結(jié)果說明Ser278的磷酸化是ICE1蛋白行使功能所必需的。遺傳分析證明,)stl ice1雙突變體表現(xiàn)凍敏感表型,過表達(dá)ICE1能回復(fù)ost1突變體凍敏感表型。 另外,本研究還發(fā)現(xiàn),OST1能與HOS1蛋白互作，并且競爭性地干擾HOS1與ICE1蛋白的互作,從而穩(wěn)定ICE1蛋白。 綜合以上結(jié)果,OST1是植物響應(yīng)低溫過程中的重要蛋白激酶。低溫快速激活OST1,激活狀態(tài)的OST1磷酸化ICE1蛋白Ser278殘基,從而增強ICE1蛋白的轉(zhuǎn)錄活性和穩(wěn)定性；同時,OST1還可以與HOS1互作,干擾HOS1與ICE1之間的相互作用,起到穩(wěn)定ICE1蛋白的作用。OST1通過以上機制穩(wěn)定ICE1蛋白,正調(diào)節(jié)CBFs的表達(dá),從而正調(diào)控植物對低溫的應(yīng)答。本研究為闡明植物響應(yīng)低溫脅迫的分子機理提供了新的理論依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：蛋白激酶OST1 ICE1 HOS1 冷脅迫 擬南芥
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：Q945.78
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-12
• ~.略詞表12-15
• 第一章 文獻(xiàn)綜述15-42
• 1.1 低溫對植物的影響15-17
• 1.1.1 冷害對植物的影響15-16
• 1.1.2 凍害對植物的影響16-17
• 1.2 植物抵抗低溫的生理基礎(chǔ)17-19
• 1.3 植物感受低溫的機制19-22
• 1.3.1 細(xì)胞膜流動性的改變19
• 1.3.2 Ca~(2+)濃度變化及Ca~(2+)通道19-21
• 1.3.3 組氨酸蛋白激酶21-22
• 1.4 低溫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑22-26
• 1.4.1 CBFs基因概述22-23
• 1.4.2 CBF信號途徑中轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控23-24
• 1.4.3 CBF信號途徑中蛋白翻譯后的修飾調(diào)控24-25
• 1.4.4 低溫信號途徑中的轉(zhuǎn)錄后修飾調(diào)控25-26
• 1.4.5 不依賴CBF信號途徑26
• 1.5 脫落酸(ABA)研究進(jìn)展26-40
• 1.5.1 ABA的合成26-27
• 1.5.2 ABA信號途徑27-37
• 1.5.3 ABA與低溫的關(guān)系37-38
• 1.5.4 其它激素與低溫的關(guān)系38-40
• 1.6 本研究的目的和意義40-42
• 第二章 實驗材料與方法42-67
• 2.1 實驗材料42-44
• 2.1.1 植物材料42
• 2.1.2 主要菌株42
• 2.1.3 主要載體42-43
• 2.1.4 主要載體的構(gòu)建方法43-44
• 2.2 實驗所用的各種酶和試劑44-45
• 2.3 常用培養(yǎng)基和試劑的配制45-52
• 2.3.1 常用培養(yǎng)基的配制45-46
• 2.3.2 感受態(tài)制備時溶液配制46
• 2.3.3 抗生素貯存液配制46-47
• 2.3.4 擬南芥原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化試劑47
• 2.3.5 DNA提取及鑒定試劑47-48
• 2.3.6 蛋白提取緩沖液48
• 2.3.7 蛋白染色和脫色液48
• 2.3.8 蛋白質(zhì)免疫印跡實驗相關(guān)試劑48-49
• 2.3.9 原核蛋白純化試劑49
• 2.3.10 體外磷酸化緩沖液(20μL)49
• 2.3.11 膠內(nèi)磷酸化(In-gel)緩沖液49-50
• 2.3.12 農(nóng)桿菌注射煙草表達(dá)蛋白緩沖液50-51
• 2.3.13 ChIP實驗相關(guān)試劑51-52
• 2.4 主要實驗儀器52-53
• 2.5 實驗方法53-67
• 2.5.1 植物生長條件53
• 2.5.2 擬南芥基因組DNA提取53-54
• 2.5.3 擬南芥基因組RNA提取54
• 2.5.4 擬南芥總蛋白提取54
• 2.5.5 試劑盒小量提取質(zhì)粒54-55
• 2.5.6 試劑盒大量提取質(zhì)粒55-56
• 2.5.7 普通PCR擴增56
• 2.5.8 高保真PCR擴增56-57
• 2.5.9 反轉(zhuǎn)錄合成CDNA57
• 2.5.10 實時定量PCR(Real-time PCR)57
• 2.5.11 PCR產(chǎn)物或者酶切產(chǎn)物回收57-58
• 2.5.12 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備58
• 2.5.13 農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備58
• 2.5.14 DNA連接及質(zhì)粒轉(zhuǎn)化58-59
• 2.5.15 質(zhì)粒電擊轉(zhuǎn)化(用于農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化)59
• 2.5.16 酵母細(xì)胞轉(zhuǎn)化59
• 2.5.17 原核蛋白誘導(dǎo)59-60
• 2.5.18 原核蛋白純化60-61
• 2.5.19 蛋白質(zhì)免疫印跡(western blot)61
• 2.5.20 原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化61-62
• 2.5.21 煙草葉片表達(dá)蛋白62
• 2.5.22 蛋白質(zhì)免疫共沉淀62
• 2.5.23 Pull-down實驗62-63
• 2.5.24 凝膠阻滯實驗(EMSA)63
• 2.5.25 染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)63-64
• 2.5.26 體外磷酸化64-65
• 2.5.27 膠內(nèi)磷酸化(In-gel)實驗65
• 2.5.28 擬南芥凍處理實驗65
• 2.5.29 離子滲漏率測定65
• 2.5.30 GUS活性測定65-66
• 2.5.31 轉(zhuǎn)基因株系的獲得方法66
• 2.5.32 DNA的定點突變66
• 2.5.33 堿性磷酸酶(CIAP)處理實驗66-67
• 第三章 實驗結(jié)果與分析67-101
• 3.1 OST1基因缺失導(dǎo)致植物抗凍能力降低67-69
• 3.2 OST1基因回復(fù)ost1-3突變體凍敏感表型69-70
• 3.3 OST1過表達(dá)植株表現(xiàn)抗凍表型70-71
• 3.4 OST1調(diào)節(jié)CBFs及其下游COR基因的表達(dá)71-73
• 3.5 OST1蛋白激酶活性受低溫誘導(dǎo)激活73-80
• 3.5.1 低溫不改變OST1蛋白的含量和定位73-74
• 3.5.2 低溫激活OST1蛋白的激酶活性74-75
• 3.5.3 低溫激活OST1蛋白的激酶不依賴ABA含量75-76
• 3.5.4 蛋白磷酸酶ABI1抑制OST1的低溫激活76-77
• 3.5.5 ABI1負(fù)調(diào)控植物的低溫響應(yīng)77-80
• 3.6 OST1蛋白與ICE1蛋白發(fā)生相互作用80-84
• 3.6.1 OST1與ICE1在體外直接發(fā)生相互作用80-82
• 3.6.2 ICE1與SnRK2.3互作,與SnRK2.4沒有相互作用82
• 3.6.3 OST1與ICE1在植物體內(nèi)存在于同一個蛋白復(fù)合體上82-84
• 3.7 OST1磷酸化ICE1蛋白84-85
• 3.7.1 OST1體外直接磷酸化ICE184
• 3.7.2 低溫增強ICE1蛋白的體內(nèi)磷酸化程度并且依賴于OST1蛋白84-85
• 3.8 ICE1蛋白Ser278的磷酸化是其發(fā)揮功能必需的85-89
• 3.8.1 ICE1蛋白Ser278是OST1磷酸化ICE1的直接靶位點85-86
• 3.8.2 ICE1蛋白Ser278的磷酸化是其發(fā)揮功能必需的86-89
• 3.9 OST1增強ICE1蛋白的穩(wěn)定性89-92
• 3.9.1 低溫處理早期時的ICE1蛋白相對穩(wěn)定89
• 3.9.2 OST1增強ICE1蛋白的穩(wěn)定性89-91
• 3.9.3 ICE1蛋白的磷酸化是其蛋白穩(wěn)定必須的91-92
• 3.10 OST1增強ICE1蛋白的轉(zhuǎn)錄活性92-94
• 3.11 OST1與HOS1存在相互作用94-95
• 3.12 OST1干擾HOS1與ICE1的相互作用95-98
• 3.12.1 OST1干擾HOS1與ICE1的相互作用95-97
• 3.12.2 磷酸化形式的ICE1與HOS1的互作強度減弱97-98
• 3.13 OST1與ICE1的遺傳關(guān)系分析98-101
• 3.13.1 ost1與ice1的雙突變體表現(xiàn)凍敏感表型98
• 3.13.2 過表達(dá)ICE1回復(fù)ost1凍敏感表型98-101
• 第四章 討論與展望101-106
• 4.1 低溫條件下OST1蛋白激酶活性的調(diào)控101-103
• 4.2 低溫增強OST1介導(dǎo)的ICE1的磷酸化103-104
• 4.3 氣孔與植物響應(yīng)低溫的關(guān)系104-106
• 第五章 結(jié)論106-107
• 參考文獻(xiàn)107-127
• 附錄127-129
• 致謝129-131
• 個人簡介131

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 ;ROP11 GTPase is a Negative Regulator of Multiple ABA Responses in Arabidopsis[J];Journal of Integrative Plant Biology;2012年03期

2 Viswanathan Chinnusamy;Ray Bressan;;ROP11 GTPase Negatively Regulates ABA Signaling by Protecting ABI1 Phosphatase Activity from Inhibition by the ABA Receptor RCAR1/PYL9 in Arabidopsis[J];Journal of Integrative Plant Biology;2012年03期

  本文關(guān)鍵詞：蛋白激酶OST1調(diào)控擬南芥響應(yīng)低溫脅迫的分子機制，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：302224