隨著“后基因組時(shí)代”的到來,一方面功能基因組學(xué)研究基因間相互作用、代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的需求日益迫切,另一方面在植物生長(zhǎng)發(fā)育過程中遺傳冗余卻大量存在,這種情況下,只有同時(shí)敲除多個(gè)基因或位點(diǎn)才能獲得特定的能顯現(xiàn)的表型,以達(dá)到為功能基因組學(xué)研究、遺傳育種提供素材的目的。盡管隨著基因組編輯技術(shù)的發(fā)展,近幾年來在植株水平,對(duì)單個(gè)基因或同時(shí)對(duì)兩個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行敲除編輯已經(jīng)實(shí)現(xiàn),但是如若想獲得多個(gè)基因同時(shí)突變且穩(wěn)定遺傳的突變體,按照傳統(tǒng)雜交育種思路,不但累加突變并純合化的過程極為耗時(shí),而且當(dāng)突變基因個(gè)數(shù)增長(zhǎng)到一定數(shù)量時(shí),雜交后基因型檢測(cè)的工作量之大也是難以承受的。除此之外,多個(gè)位點(diǎn)的同時(shí)敲除,對(duì)于像小麥、燕麥、煙草、棉花等多倍體植物的研究也非常有意義。盡管多基因/多位點(diǎn)同時(shí)敲除意義重大,雖然利用鋅指蛋白酶、TALEN等基因組編輯技術(shù)于幾年前實(shí)現(xiàn)了植物中單個(gè)基因的敲除,但是因?yàn)榧夹g(shù)自身的局限性,植物中多基因敲除在整個(gè)植物學(xué)界進(jìn)展緩慢。在我們TALEN基因組編輯技術(shù)應(yīng)用成功后,改造用于多基因敲除TALEN技術(shù)的課題陷入僵局時(shí),CRISPR/Cas9技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生,因?yàn)镃RISPR/Cas9系統(tǒng)含有轉(zhuǎn)錄后相互獨(dú)立的Ca... 

【文章來源】：重慶大學(xué)重慶市 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：118 頁

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
中文摘要
英文摘要
縮略詞
1 引言
    1.1 植物基因組與功能基因組學(xué)研究基礎(chǔ)
        1.1.1 立足全基因組水平、注重多基因間相互作用的“后基因組時(shí)代”
        1.1.2 植物功能基因組研究的主要技術(shù)方法及其特點(diǎn)
    1.2 基因組定點(diǎn)編輯技術(shù)的發(fā)展及其應(yīng)用前景
        1.2.1 鋅指核酸酶（zinc finger nuclease，ZFN）
        1.2.2 類轉(zhuǎn)錄激活效應(yīng)因子核酸酶（TALEN）
        1.2.3 CRISPR/Cas9系統(tǒng) （Clustered regularly interspaced short palindromicrepeats/CRISPR associated systems）
        1.2.4 基因組編輯技術(shù)的比較與CRISPR/Cas9在多基因敲除中的優(yōu)勢(shì)
    1.3 單基因敲除、大片段刪除及多個(gè)基因同時(shí)敲除策略
        1.3.1 單個(gè)基因完全功能敲除
        1.3.2 基因組大片段刪除
        1.3.3 同一個(gè)體中多基因同時(shí)敲除
    1.4 突變體靶位點(diǎn)篩選方法比較
    1.5 用于基因組編輯技術(shù)的植物（擬南芥、番茄）轉(zhuǎn)化方法及檢測(cè)時(shí)期
    1.6 基因組編輯植物的生物安全性
    1.7 研究意義及立題依據(jù)
    1.8 本研究的技術(shù)路線
2 CRISPR／CAS9系統(tǒng)介導(dǎo)的擬南芥IDM3單個(gè)基因編輯敲除及IDM3參與去甲基化過程的研究
    2.1 材料與方法
        2.1.1 CRISPR／Cas9系統(tǒng)sg RNA的設(shè)計(jì)與表達(dá)載體的組裝
        2.1.2 轉(zhuǎn)基因及轉(zhuǎn)基因陽性植株篩選
        2.1.3 突變體的篩選與鑒定
        2.1.4 Chop-PCR檢測(cè)idm3突變體的甲基化程度
    2.2 結(jié)果與討論
        2.2.1 轉(zhuǎn)基因個(gè)體及成功敲除個(gè)體的篩選
        2.2.2 IDM3促進(jìn)擬南芥的去甲基化過程
    2.3 小結(jié)
3 運(yùn)用CRISPR /CAS9系統(tǒng)通過基因組長(zhǎng)片段刪除敲除單個(gè)基因
    3.1 材料與方法
        3.1.1 用于長(zhǎng)片段刪除的sg RNAs設(shè)計(jì)與表達(dá)載體組裝
        3.1.2 轉(zhuǎn)基因及轉(zhuǎn)基因陽性植株的篩選
        3.1.3 CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)的擬南芥基因組長(zhǎng)片段刪除
    3.2 結(jié)果與討論
        3.2.1 T1代AFLP檢測(cè)篩選及測(cè)序結(jié)果
        3.2.2 T2代大片段刪除檢測(cè)及穩(wěn)定株系的獲得
    3.3 小結(jié)
4 擬南芥PYL基因家族多基因敲除突變體庫的構(gòu)建與基因功能初步研究
    4.1 材料與方法
        4.1.1 擬南芥PYLs多基因敲除sg RNA設(shè)計(jì)與表達(dá)載體組裝
        4.1.2 轉(zhuǎn)化植株及PYLs多基因突變體庫篩選方法
    4.2 結(jié)果與討論
        4.2.1 轉(zhuǎn)基因及多基因敲除個(gè)體的篩選
        4.2.2 T2純合多基因突變體的獲得及表型和基因功能初步分析
    4.3 小結(jié)
5 CRISPR/CAS9系統(tǒng)的廣適性驗(yàn)證
    5.1 材料與方法
        5.1.1 用于番茄基因敲除的sg RNA設(shè)計(jì)與表達(dá)載體組裝
        5.1.2 番茄組織培養(yǎng)轉(zhuǎn)化與誘導(dǎo)成苗
    5.2 結(jié)果與討論
        5.2.1 轉(zhuǎn)基因個(gè)體及成功敲除個(gè)體的篩選
    5.3 小結(jié)
6 總結(jié)與展望
7 創(chuàng)新點(diǎn)
致謝
參考文獻(xiàn)
附錄1
    A. 博士期間發(fā)表及待發(fā)表的文章
附錄2
    A. 文中涉及關(guān)鍵基因或原件的序列
    B. 文中所用部分引物


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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[2]RNAi機(jī)制及在植物中應(yīng)用的研究概述[J]. 崔喜艷,孫小杰,劉忠野,張繼偉.  吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào). 2013(02)
[3]水稻功能基因圖位克隆研究進(jìn)展[J]. 童繼平,劉學(xué)軍,韓傲男,馬忠友,劉敏.  中國(guó)生物工程雜志. 2012(03)
[4]我國(guó)轉(zhuǎn)基因植物研發(fā)形勢(shì)及發(fā)展戰(zhàn)略[J]. 萬建民.  生命科學(xué). 2011(02)
[5]植物RNAi的特點(diǎn)及其應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 白描,楊國(guó)順,陳石,張美玲.  生物技術(shù)通報(bào). 2009(08)
[6]反向遺傳學(xué)在現(xiàn)代生物學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用[J]. 楊宇,王丹,李浩戈.  生物技術(shù)通報(bào). 2009(05)
[7]功能基因組學(xué)的研究?jī)?nèi)容與方法[J]. 趙劍華,王秀琴,劉芝華,吳.  生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展. 2000(01)



本文編號(hào)：3008477