抑癌因子p53在DNA損傷下被激活,抑制細胞周期或促進細胞凋亡,從而保證遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定性。但p53抑制DNA雙鏈斷裂修復,似乎與其抑癌的特性相矛盾。p53缺陷容易導致腫瘤發(fā)生,且p53缺陷的癌細胞對放療化療不敏感。大量證據(jù)顯示p53可被各種脅迫激活并作出不同反應,甚至在同種信號下根據(jù)不同強度的刺激產(chǎn)生截然相反的作用,然而其中的分子機制仍有待研究。近年來已證明p53家族中存在著多種異構(gòu)體p53,它們可以協(xié)同或拮抗p53調(diào)節(jié)下游信號通路,但對其功能和生物學意義的研究才剛剛開始。此外,p53可被高溫激活,但它究竟起著怎樣的作用還未曾報導。本論文從以下幾個方面來探討這些科學問題。1、我們發(fā)現(xiàn)△133p53/△113p53僅能被γ射線照射誘導表達,而不能被高溫和UV照射誘導表達。進一步研究發(fā)現(xiàn)△133p53/△113p53能從轉(zhuǎn)錄水平上提高DNA雙鏈斷裂修復的關鍵基因表達,從而促進HR、SSA、NHEJ三種不同修復途徑,它不僅能提高生物體在DNA雙鏈斷裂損傷下生存能力,而且維持了遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定性。2、在誘導細胞重編程產(chǎn)生IPS的過程中,基因組DNA會因劇烈的修飾和空間結(jié)構(gòu)變化產(chǎn)生損傷。我們發(fā)現(xiàn)△... 

【文章來源】：浙江大學浙江省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

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【學位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略詞表
1 研究背景和基礎理論依據(jù)
    1.1 p53家族
    1.2 p53異構(gòu)體
    1.3 DNA損傷與修復信號通路
    1.4 p53家族與IPS
    1.5 p53家族與ROS調(diào)控
    1.6 分子伴侶介導自噬（CMA）
    1.7 斑馬魚模式生物簡介
2 研究材料與方法總述
    2.1 人類細胞系實驗體系及相關實驗操作
        2.1.1 實驗用細胞系的常規(guī)培養(yǎng)
        2.1.2 細胞轉(zhuǎn)染
    2.2 人類干細胞實驗體系、IPS及相關實驗操作
        2.2.1 實驗用干細胞的正常培養(yǎng)
        2.2.2 慢病毒的準備
        2.2.3 細胞重編程
    2.3 斑馬魚體系及相關實驗操作
        2.3.1 實驗用斑馬魚的品系及飼養(yǎng)
        2.3.2 斑馬魚受精卵的獲取
        2.3.3 受精卵顯微注射
    2.4 小鼠體系及相關實驗操作
        2.4.1 實驗小鼠品系及飼養(yǎng)
        2.4.2 腫瘤移植
        2.4.3 動物實驗中遵循的倫理規(guī)范
    2.5 分子克隆及相關實驗方法
        2.5.1 DNA片段及相關操作
        2.5.2 感受態(tài)細胞及相關操作
    2.6 DNA相關實驗總述
        2.6.1 基因組總DNA的提取
        2.6.2 PI染色測定細胞周期及凋亡
        2.6.3 Annexin V/7-AAD雙熒光染色檢測細胞凋亡與壞死
        2.6.4 Tune1方法檢測斑馬魚細胞凋亡
        2.6.5 Comet試驗檢測DNA損傷
    2.7 RNA相關實驗總述
        2.7.1 RNA的提取
        2.7.2 逆轉(zhuǎn)錄及qPCR
        2.7.3 半定量PCR
        2.7.4 體外轉(zhuǎn)錄mRNA
        2.7.5 Northern-blot
    2.8 蛋白相關實驗總述
        2.8.1 蛋白的提取
        2.8.2 Western-blot
        2.8.3 蛋白質(zhì)降解檢測
        2.8.4 免疫熒光
        2.8.5 蛋白免疫共沉淀
        2.8.6 染色質(zhì)免疫共沉淀（ChIP）
        2.8.7 凝膠阻滯實驗（EMSA）
    2.9 細胞相關實驗總述
        2.9.1 流式細胞分析（FACS）
        2.9.2 細胞集落生成實驗（CCA）
        2.9.3 細胞活性測定（MTT）
        2.9.4 細胞衰老檢測
        2.9.5 活性氧檢測（ROS assay）
        2.9.6 GFP-LC3聚集實驗（GFP-LC3 aggregation）
    2.10 實驗中所用試劑總述
        2.10.1 常規(guī)試劑配方列表
        2.10.2 實驗中所用抗體列表
        2.10.3 實驗中所用Morpholino、siRNA列表
        2.10.4 實驗中所用qPCR引物列表
        2.10.5 實驗中所用探針合成用引物列表
        2.10.6 實驗中所用克隆用引物列表
3 可視化DNA雙鏈斷裂修復檢測系統(tǒng)
    3.1 HR、SSA、NHEJ質(zhì)粒的構(gòu)建
    3.2 基于qPCR方法的定量檢測HR、SSA、NHEJ強度系統(tǒng)的構(gòu)建與檢驗
    3.3 利用可視化檢測系統(tǒng)檢測斑馬魚中DNA雙鏈斷裂修復的強度
    3.4 可視化DNA雙鏈斷裂修復檢測系統(tǒng)的應用
4 △133p53促進DNA雙鏈斷裂修復
    4.1 γ射線輻射能誘導△113p53/△133p53大量表達
    4.2 在斑馬魚中△113p53能促進DNA雙鏈斷裂修復,降低DNA損傷積累
    4.3 在人類細胞系中△133p53能促進DNA雙鏈斷裂修復,降低DNA損傷積累
    4.4 △113p53在DNA雙鏈損傷嚴重時保護斑馬魚,抑制衰老和死亡
    4.5 △133p53在DNA雙鏈損傷嚴重時保護人類細胞,抑制衰老和死亡
    4.6 △113p53/△133p53促進DNA雙鏈斷裂修復關鍵基因的表達
    4.7 △113p53/△133p53直接調(diào)控DNA雙鏈斷裂修復途徑關鍵基因的轉(zhuǎn)錄
    4.8 在DNA雙鏈斷裂下p53信號途徑調(diào)控細胞命運模型
    4.9 結(jié)果討論
5 △133p53提高IPSC誘導效率并維持基因組穩(wěn)定性
    5.1 在細胞重編程過程中△133p53能被誘導產(chǎn)生
    5.2 △133p53能大幅提高IPS重編程效率
    5.3 △133p53在重編程過程中拮抗p53促進產(chǎn)生的細胞凋亡
    5.4 △133p53在重編程過程中促進細胞DNA雙鏈斷裂修復
    5.5 △133p53在重編程過程中保護基因組穩(wěn)定性
    5.6 細胞重編程后產(chǎn)生IPSC的鑒定
    5.7 在細胞重編程時△133p53的功能模型
    5.8 結(jié)果討論
6 △133p53提高機體在低劑量氧化環(huán)境中的適應性
    6.1 △133p53在低劑量氧化環(huán)境中被誘導表達
    6.2 △133p53優(yōu)化細胞對低劑量氧化環(huán)境的適應性
    6.3 △113p53優(yōu)化斑馬魚對低劑量氧化環(huán)境的適應性
    6.4 △133p53降低細胞內(nèi)ROS水平
    6.5 △133p53通過調(diào)節(jié)抗ROS基因的表達從而降低細胞內(nèi)ROS水平
    6.6 △133p53直接參與抗ROS基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控
    6.7 機體應對長期低劑量氧化環(huán)境的可能的策略模型
    6.8 結(jié)果討論
7 在高溫下p53抑制過度的CMA保護細胞免于死亡
M214K突變品系比野生型斑馬魚對于40℃相對高溫更敏感">    7.1 p53^M214K突變品系比野生型斑馬魚對于40℃相對高溫更敏感
    7.2 p53缺陷細胞系比p53正常細胞系對于40℃相對高溫更敏感
    7.3 p53缺陷細胞系比p53正常細胞系對于40℃相對高溫更敏感不是由細胞凋亡、壞死和大自噬導致
    7.4 p53缺陷細胞系比p53正常細胞系對于40℃相對高溫更敏感是由CMA導致
    7.5 p53通過p53-HSF1-HSC70信號通路抑制CMA,從而在40℃相對高溫下保護人類細胞免于死亡
    7.6 p53通過p53-HSF1-HSC70信號通路抑制CMA,從而在40℃相對高溫下保護斑馬魚免于死亡
    7.7 p53在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控HSF1表達
    7.8 p53在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控HSF1表達的分子機制
    7.9 p53缺陷移植瘤細胞對40℃相對高溫處理較p53正常細胞敏感
    7.10 結(jié)果討論
8 研究總結(jié)
    8.1 結(jié)論與意義
    8.2 課題展望
參考文獻
作者簡介
致謝



本文編號：2967322