發(fā)布時(shí)間：2020-11-07 14:44

　　 龍眼(Dimocarpus longan Lour.)是熱帶亞熱帶重要果樹,具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。龍眼易受超過20種采前和采后病害的影響,隨著全球性的對(duì)環(huán)境及食品安全的日益重視,培育減少化學(xué)農(nóng)藥依賴的新型品種是農(nóng)作物育種的重要方向。但龍眼育種周期長(zhǎng),抗性育種進(jìn)展緩慢,對(duì)龍眼抗性機(jī)制產(chǎn)生的分子機(jī)理所知甚少。此前,我們進(jìn)行了龍眼胚性培養(yǎng)物的轉(zhuǎn)錄組高通量測(cè)序,從中發(fā)現(xiàn)大量植物-病原物互作相關(guān)基因的表達(dá),其數(shù)量占所有Unigene的8.15%,這為快速獲取龍眼抗性相關(guān)基因信息奠定了基礎(chǔ)。本文擬在此基礎(chǔ)上,利用同源克隆結(jié)合生物信息學(xué)的方法挖掘鑒定龍眼轉(zhuǎn)錄組中的NBS-LRR抗性基因、抗性相關(guān)激素信號(hào)基因以及具有廣譜抗性特性的鐵氧還蛋白家族基因,并通過進(jìn)一步的生物信息學(xué)、qPCR定量表達(dá)和轉(zhuǎn)基因異位表達(dá)分析,進(jìn)行基因的功能驗(yàn)證,為龍眼及其他物種的抗性育種提供科學(xué)依據(jù)。1龍眼抗性基因的同源克隆NBS-LRR基因是抗性基因(Resistance gene, R gene)中的重要類型,通過其保守功能域進(jìn)行同源克隆可以迅速獲得不同物種的R基因信息。通過R基因NBS保守功能域基序P-loop、Kinase-2和GLPL (AL)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物,回收相應(yīng)的條帶測(cè)序,在55個(gè)陽性克隆子中,共得到46條序列與已知NBS序列具有同源性,且彼此間沒有重復(fù)的序列,將46條序列分別命名為NBS(X), 并登錄GenBank,登錄號(hào)分別為JQ900202-JQ900227、JX007920-JX007923、JN398315-JN398318、JN398320-JN398329。將所獲得序列的推導(dǎo)氨基酸序列進(jìn)行多重比對(duì),可見明顯的P-loop、RNBS-A、Kinase-2、 RNBS-B 和 GLPL (AL)保守基因,其中,4條序列Kinase-2基序符合TIR-NBS-LRR(TN L)類型R基因特征,42條序列符合CC-NBS-LRR(CNL)類型R基因特征。進(jìn)化樹分析顯示,46條序列可分為TNL及non-TNL兩大類群,其中,non-TNL雙可進(jìn)一步分為4個(gè)亞類群�；蚍治鲲@示,non-TNLl及non-TNL2類群成員之員較為一致,但沒有聚類到已知類型的R基因,可能為龍眼特有的類群。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),盡管龍眼胚性培養(yǎng)物存在于無菌條件下同,但存在類型豐富的R基因表達(dá),利用簡(jiǎn)并引物是快速了解在龍眼培養(yǎng)性培養(yǎng)物中所表達(dá)R基因類型的快速而有效的方法一。2 龍眼胚性培養(yǎng)物轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)R基因的挖掘盡管利用同源克隆法可對(duì)基序較為保守的R基因進(jìn)行有效的分離,但難以對(duì)全基因組或轉(zhuǎn)錄組范圍內(nèi)表達(dá)的R基因進(jìn)行較為全面的篩選。本試驗(yàn)通過關(guān)鍵詞結(jié)合批量BLAST在龍眼胚性培養(yǎng)物轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)挖掘R基因,在全部68925條Unigene中在得到1406條不重復(fù)的序列與抗性相關(guān),其中含有NB-ARC結(jié)構(gòu)域的221條,含有TIR結(jié)構(gòu)的40條。通過對(duì)相對(duì)具有完整NBS結(jié)構(gòu)的73條序列進(jìn)行進(jìn)化樹分析,發(fā)現(xiàn)類群劃分與上述同源克隆所獲得序列進(jìn)化樹分析結(jié)果相似。所有R基因中TNL類群15條,占24.7%,而non-TNL類群的R基因58條,占75.3%。non-TNL1、non-TNL2亞類群無論在序列及基序方面均與現(xiàn)有其他物種R基因呈現(xiàn)較大差異。通過miRNA基因的靶向分析發(fā)現(xiàn),miR482較傾向于靶向較為保守的non-TNL3類群,而miR5018均靶向龍眼中特有的non-TNL1亞類群,而在其他物種中,還未發(fā)現(xiàn)miR5018與R基因的靶向關(guān)系。利用龍眼胚性培養(yǎng)物轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行基因挖掘可以迅速鑒定大量R基因,在龍眼胚性培養(yǎng)物轉(zhuǎn)錄組范圍內(nèi),龍眼R基因主要由non-TNL類型構(gòu)成。3龍眼抗性基因的全長(zhǎng)克隆及病原物侵染下的表達(dá)分析為驗(yàn)證所獲得的R基因兩端序列的類型,以及進(jìn)一步鑒定R基因的生理功能,本試驗(yàn)通過RACE克隆技術(shù)共獲得13條龍眼R基因序列全長(zhǎng),GenBank登錄號(hào)為JQ900226,KP266525-KP266536。通過與其他物種R基因進(jìn)行比對(duì),發(fā)現(xiàn)龍眼R基因與甜橙R基因最為相似,一致性在66-79%之間。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),所獲得R基因均沒有明顯的信號(hào)肽,但可能定位于不同的細(xì)胞器。通過對(duì)獲得全長(zhǎng)及被niRNA所靶向的R基因進(jìn)行表達(dá)分析顯示,R基因在葉片中的表達(dá)量顯著高于在龍眼胚性愈傷組織中的表達(dá)量,并且多數(shù)R基因在病原物侵染后呈現(xiàn)表達(dá)量的提高,其中,被niRNA預(yù)測(cè)靶向的R基因在病原物侵染后表現(xiàn)更為明顯的表達(dá)變化；在不同信號(hào)激素下,不同成員呈現(xiàn)不同的表達(dá)規(guī)律。結(jié)果表明,龍眼R基因家族龐大,進(jìn)化程度高,在抗性過程中存在復(fù)雜的表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。本試驗(yàn)通過龍眼R基因特別是不同亞類群R基因全長(zhǎng)的克隆及表達(dá)分析,初步了解龍眼R基因的組成類型,并為進(jìn)一步的R基因功能轉(zhuǎn)化鑒定提供了可能。4龍眼抗性相關(guān)激素信號(hào)標(biāo)記基因克隆與表達(dá)分析在龍眼中,病原物與植株的互作的分子機(jī)制還所知甚少,影響了對(duì)龍眼R基因的功能鑒定的進(jìn)行�？剐韵嚓P(guān)激素信號(hào)標(biāo)記基因的克隆與鑒定是研究植物與病原物互作的良好工具。本試驗(yàn)利用擬南芥水楊酸信號(hào)標(biāo)記途徑基因PR1,(AT2G14610)、PR2(AT3G57260)、茉莉酸／乙’烯信號(hào)途徑標(biāo)記基因ERF1(AT3G23240)、茉莉酸信號(hào)途徑標(biāo)記基因VSP2(AT5G24770)、乙烯信號(hào)途徑標(biāo)記基因PDE1.2(AT5G44420)于龍眼胚性培養(yǎng)物轉(zhuǎn)錄組挖掘同源序列,并進(jìn)行全長(zhǎng)克隆,共獲得9條全長(zhǎng)及1條5'序列的水楊酸、茉莉酸及乙烯信號(hào)途徑標(biāo)記基因,GenBank登錄號(hào)為KP266536-KP66545。經(jīng)BLAST及保守功能域分析,所獲得序列均與擬南芥相應(yīng)標(biāo)記基因具有一致性。通過熒光定量分析發(fā)現(xiàn),除VSP2-1,所有序列可響應(yīng)病原物的侵染上調(diào)表達(dá)。在不同激素處理下,發(fā)現(xiàn)龍眼PRl-1、PR2-1、ERF1-2、 VSP2-2、PDF1.2-1與相應(yīng)的同源擬南芥標(biāo)記基因較為類似,能特異響應(yīng)SA、ET及JA信號(hào)處理。結(jié)果表明,利用同源克隆法可以在龍眼得到特異性響應(yīng)不同激素的標(biāo)記基因,是快速獲取此類基因的方法一,此類基因的克隆,將對(duì)將來R基因功能的鑒定及龍眼與病原物互作的分子機(jī)制提供重要的分析工具。5龍眼廣譜抗性基因鐵氧還蛋白的克隆、亞細(xì)胞定位與表達(dá)分析R基因通過直接或間接識(shí)別病原效應(yīng)因子,對(duì)病原物的識(shí)別具有�；�,而鐵氧還蛋白作為光合電子傳遞鏈的關(guān)鍵蛋白,在多種植物上被證實(shí)具有廣譜的對(duì)抗生物及非生物脅迫的能力。利用數(shù)據(jù)庫(kù)基因挖掘并結(jié)合RACE技術(shù),本試驗(yàn)獲得5條Fd全長(zhǎng)基因序列,GenBank登錄號(hào)分別為JF733784、JF957855、JF957856、JF957857及JF957858。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示,所獲得的鐵氧還蛋白分別為葉綠體類非光合類型的Fd3、FdC1、FdC2以及線粒體類的MFDX基因。將Fd3、FdC1導(dǎo)入煙草進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析,發(fā)現(xiàn)二者均定位于葉綠體,與所預(yù)測(cè)位置相符。所有類型的鐵氧還蛋白在體胚發(fā)生過程有類似的表達(dá)模式,并在心形胚時(shí)期大量表達(dá)。6異位表達(dá)龍眼鐵氧還蛋白文心蘭的抗病性與基因表達(dá)變化分析利用此前已建立的高效文心蘭農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化體系,將龍眼Fd3、FdCl基因?qū)胛男奶m原球莖,通過一系列篩選培養(yǎng)獲得再生植株,發(fā)現(xiàn)Fd3基因可以提高文心蘭對(duì)抗軟腐病的能力及移栽成活率。印度梨型孢菌是研究植物與菌共生互作的模式菌株,可為共生植株帶來廣譜抗性。印度梨型孢菌是研究菌與植物共生的模式菌株,能為寄主植物帶來廣譜抗性。通過miRNA高通量測(cè)序及qPCR基因表達(dá)分析顯示,在共生過程中,miRNA通過調(diào)控生長(zhǎng)素相關(guān)基因及發(fā)育相關(guān)基因參與共生關(guān)系的建立。異位表達(dá)龍眼Fd3植株在接種印度梨型孢菌后顯著改變了文心蘭miR166、miR168、miR169與miR397及其靶基因PHV、AGO、NTF與LAC的表達(dá)水平,而轉(zhuǎn)化龍眼FdCl植株呈現(xiàn)相反的表達(dá)趨勢(shì)。綜上所述,本試驗(yàn)通過同源克隆法與轉(zhuǎn)錄組挖掘技術(shù)相結(jié)合,分離了大量的龍眼R基因片段并獲得13條的全長(zhǎng)序列,進(jìn)而對(duì)R基因在病原物侵染下及不同激素信號(hào)調(diào)控下的表達(dá)模式分析,發(fā)現(xiàn)植株可能通過整體調(diào)控R基因來響應(yīng)病原物的侵染以獲得SAR,其中miRNA所預(yù)測(cè)靶向的R基因在病原物侵染后呈現(xiàn)更為顯著的上調(diào)表達(dá)；為進(jìn)一步鑒定R基因的功能,從龍眼轉(zhuǎn)錄組中挖掘與擬南芥抗性相關(guān)激素信號(hào)標(biāo)記基因具有一致性的序列并獲得9條全長(zhǎng)序列及1條5'末端序列,其中PR1-1、PR2-1、ERF1-2、VSP2-2、PDF1.2-1能特異性響應(yīng)相關(guān)激素信號(hào)；進(jìn)行了廣譜抗性基因Fd基因在龍眼胚性培養(yǎng)物轉(zhuǎn)錄組的基因挖掘與克隆,共獲得5條Fd全長(zhǎng)基因序列,分別為葉綠體類非光合類型的Fd3、FdC1、FdC2以及線粒體類的MFDX基因,利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將龍眼Fd3、FdCl基因?qū)胛男奶m原球莖,通過一系列篩選培養(yǎng)獲得再生植株,發(fā)現(xiàn)Fd3基因可以提高文心蘭對(duì)抗軟腐病的能力及移栽成活率,異位表達(dá)Fd3植株在接種印度梨型孢菌后顯著改變了文心蘭miRNA及其靶基因PHV、NTF、AGO及LAC的表達(dá)水平。本試驗(yàn)的研究結(jié)果將為進(jìn)一步挖掘鑒定有效的龍眼抗性相關(guān)基因提供幫助,并為龍眼及其他物種的分子抗性育種提供科學(xué)依據(jù)。
【學(xué)位單位】：福建農(nóng)林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：S667.2;Q943.2
【文章目錄】：
縮寫詞
摘要
Abstract
引言
    1 植物體胚發(fā)生抗性相關(guān)基因克隆研究進(jìn)展
    2 植物抗病防御機(jī)制研究進(jìn)展
        2.1 R基因的研究進(jìn)展
        2.2 植物激素信號(hào)途徑抗性相關(guān)基因研究進(jìn)展
        2.3 廣譜抗性基因鐵氧還蛋白基因在植物抗性育種中的研究進(jìn)展
    3 龍眼抗性基因工程研究進(jìn)展
    4 本研究的意義和主要內(nèi)容
第一章 龍眼抗性基因的同源克隆
    1 材料與方法
        1.1 材料
        1.2 方法
    2 結(jié)果與分析
        2.1 龍眼RGA序列擴(kuò)增
        2.2 龍眼RGA氨基酸序列多重序列比對(duì)
        2.3 龍眼RGA序列進(jìn)化樹分析
        2.4 龍眼RGA氨基酸序列基序分析
        2.5 龍眼miRNA靶向的RGA序列預(yù)測(cè)
    3 討論
        3.1 利用龍眼EC cDNA是進(jìn)行NBS類R基因克隆的良好材料
        3.2 non-TNL類型為簡(jiǎn)并引物克隆RGA序列的主要類型
        3.3 龍眼RGA中存在可變剪接的序列
第二章 龍眼胚性愈傷轉(zhuǎn)錄組抗性基因的挖掘與鑒定
    1 材料與方法
        1.1 基因挖掘
        1.2 序列分析
    2 結(jié)果
        2.1 龍眼轉(zhuǎn)錄組R基因的挖掘
        2.2 龍眼轉(zhuǎn)錄組R基因的進(jìn)化樹分析
        2.3 miRNA靶向龍眼NBS序列預(yù)測(cè)
    3 討論
        3.1 龍眼EC存在表達(dá)類型豐富的R基因
        3.2 non-TNL類型R基因?yàn)辇堁跼基因的主要類型
        3.3 龍眼non-TNL1及non-TNL2亞類群R基因較不保守
第三章 龍眼R基因全長(zhǎng)的克隆及定量表達(dá)分析
    1 材料與方法
        1.1 材料
        1.2 方法
    2 結(jié)果
        2.1 龍眼R基因全長(zhǎng)克隆
        2.2 龍眼R基因生物信息學(xué)分析
        2.3 龍眼R基因的熒光定量表達(dá)分析
    3 討論
        3.1 龍眼R基因與其他物種R基因呈現(xiàn)較大的差異
        3.2 龍眼CNL類型R基因CC結(jié)構(gòu)的生理功能
        3.3 龍眼R基因可能通過整體響應(yīng)病原物的侵染使植株產(chǎn)生SAR
        3.4 靶向龍眼R基因的miRNA可能在植物與病原物的互作中產(chǎn)生重要作用
第四章 龍眼抗性相關(guān)激素信號(hào)途徑標(biāo)記基因的克隆與表達(dá)分析
    1 材料與方法
        1.1 材料
        1.2 方法
    2 結(jié)果
        2.1 龍眼不同激素信號(hào)途徑標(biāo)記基因挖掘
        2.2 龍眼不同激素信號(hào)途徑標(biāo)記基因序列分析
        2.3 龍眼不同激素信號(hào)途徑標(biāo)記基因熒光定量表達(dá)分析
    3 討論
        3.1 龍眼胚性培養(yǎng)物中不同激素信號(hào)途徑標(biāo)記基因
        3.2 龍眼激素信號(hào)途徑標(biāo)記基因家族不同成員在病原物及激素處理下呈現(xiàn)不同的表達(dá)規(guī)律
第五章 龍眼鐵氧還蛋白家族基因的克隆及表達(dá)分析
    1 材料與方法
        1.1 材料
        1.2 方法
    2 結(jié)果與分析
        2.1 龍眼轉(zhuǎn)錄中Fd及Fld家族基因的挖掘
        2.2 龍眼Fd及tyw1基因全長(zhǎng)克隆
        2.3 龍眼Fd及tyw1基因序列分析
        2.4 龍眼Fd基因亞細(xì)胞定位
        2.5 龍眼不同類型Fd基因在EC不同階段表達(dá)分析
    3 討論
        3.1 龍眼EC中表達(dá)的Fd基因類型
        3.2 龍眼Fd基因在龍眼體細(xì)胞胚胎發(fā)生的作用
        3.3 龍眼tyw1基因與[Fe-S]簇結(jié)合在龍眼胚胎發(fā)生過程中參與RNA轉(zhuǎn)錄后修飾
第六章 龍眼鐵氧還蛋白基因在文心蘭異位表達(dá)
    1 材料與方法
        1.1 材料
        1.2 方法
    2 結(jié)果
        2.1 文心蘭PLB抗性培養(yǎng)
        2.2 不同農(nóng)桿菌菌株對(duì)文心蘭PLB的轉(zhuǎn)化效率影響
        2.3 轉(zhuǎn)化文心蘭植物的陽性檢測(cè)
        2.4 轉(zhuǎn)化文心蘭植物的抗軟腐病檢測(cè)
    3 討論
        3.1 文心蘭基因轉(zhuǎn)化的篩選標(biāo)記基因
        3.2 不同品種農(nóng)桿菌對(duì)文心蘭轉(zhuǎn)化效率影響
        3.3 龍眼Fd3較FdC1抗軟腐病效應(yīng)明顯
第七章 異位表達(dá)龍眼鐵氧還蛋白在文心蘭與印度梨形孢共生中的MIRNA表達(dá)變化
    1 材料與方法
        1.1 材料
        1.2 方法
    2 結(jié)果
        2.1 印度梨形孢促文心蘭生長(zhǎng)與生根效應(yīng)
        2.2 文心蘭miRNA及其靶基因的注釋
        2.3 轉(zhuǎn)化龍眼Fd基因文心蘭miRNA及其靶基因的熒光定量分析
    3 討論
        3.1 miR156與miR397在轉(zhuǎn)化龍眼Fd基因的植株中呈現(xiàn)不同的表達(dá)規(guī)律
        3.2 龍眼Fd3可能促進(jìn)梨形孢在文心蘭的共生進(jìn)程的建立
主要結(jié)論及創(chuàng)新點(diǎn)
參考文獻(xiàn)
附錄一 46條同源克隆RGA核酸序列
附錄二 龍眼R基因全長(zhǎng)序列
附錄三 13條NBS-LRR類R基因全長(zhǎng)蛋白序列多重比對(duì)分析
附錄四 龍眼抗性相關(guān)激素信號(hào)途徑標(biāo)記基因核酸序列
附錄五 龍眼鐵氧還蛋白家族基因核酸序列
在讀博士期間發(fā)表論文情況及參加學(xué)術(shù)會(huì)議情況

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2874088