研究背景：間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)因其來源廣泛,并具有多向分化能力和免疫調(diào)節(jié)功能成為最具臨床應(yīng)用前景的成體干細(xì)胞。深入了解MSCs的表面標(biāo)志對于MSCs的分離、純化、鑒定、功能研究以及最終在臨床治療應(yīng)用中細(xì)胞類型的選擇都具有重要的理論和現(xiàn)實意義。雖然CD73、CD90、CD105等標(biāo)志成為MSCs公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn),但這些標(biāo)志并不能反映MSCs自我更新、多向分化以及對微環(huán)境敏感性等“干性”特點。前期研究中,我們發(fā)現(xiàn)粘附分子CD49f (integrin α6)在胎兒和成人骨髓來源的MSCs (BMSCs)中呈差異性表達(dá)。粘附分子做為一類重要的細(xì)胞膜表面蛋白,其介導(dǎo)的干細(xì)胞與其微環(huán)境中支持細(xì)胞或ECM之間的相互作用是干細(xì)胞保持其干性的關(guān)鍵。CD49f不僅是一個干性相關(guān)基因,可作為多種干細(xì)胞的表面標(biāo)志,如胚胎干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞、造血干細(xì)胞等,而且通過與微環(huán)鏡中ECM成分laminin的結(jié)合在干細(xì)胞自我更新與干性維持中發(fā)揮重要作用。目前,CD49f在MSCs中的相關(guān)研究還很少,胎兒來源BMSCs中CD49f+細(xì)胞的富集是否是一類MSCs前體細(xì)胞以及CD49f能否做為BMSCs的干性標(biāo)志等有待闡明；同時,作為微環(huán)境中重要組成部分,炎癥因子可通過對粘附分子的調(diào)節(jié)將微環(huán)境中生理或病理性信號傳導(dǎo)至干細(xì)胞,CD49f是否在BMSCs感知微環(huán)境中炎癥信號并調(diào)整自身生物學(xué)特性以滿足機體需求的過程中發(fā)揮作用等問題還需進(jìn)一步研究。研究目的：1. 檢測BMSCs中CD49f+和CD49f-細(xì)胞群體在自我更新和多向分化能力方面的差異,明確CD49f是否可作為BMSCs的干性表面標(biāo)志。2.明確炎癥因子對CD49f的調(diào)控以及CD49f在BMSCs感知周圍環(huán)境中炎癥信號并調(diào)整其生物學(xué)特性過程中的作用。3.深入探討TNF-α調(diào)控BMSCs中CD49f表達(dá)的機制。研究方法和結(jié)果：1.CD49f與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的干性方法：分別應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)和Real-Time PCR的方法檢測CD49f在不同來源和不同分化能力的干細(xì)胞/細(xì)胞中的表達(dá)；通過連續(xù)傳代的方式觀察CD49f的動態(tài)變化過程以及對環(huán)境的敏感性；應(yīng)用流式細(xì)胞儀分選CD49f+及CD49f-BMSCs細(xì)胞群體,通過克隆形成實驗及成骨、成脂分化誘導(dǎo)對比二者自我更新和多向分化能力的差異。結(jié)果：胎兒BMSCs及皮膚成纖維細(xì)胞中CD49+細(xì)胞比例及mRNA表達(dá)水平遠(yuǎn)高于成人相應(yīng)細(xì)胞,而人胚胎干細(xì)胞(hESCs)及羊膜上皮細(xì)胞基本全部表達(dá)CD49f,且mRNA表達(dá)水平也較高；體外培養(yǎng)的胎兒BMSCs在形態(tài)學(xué)以及國際細(xì)胞治療協(xié)會定義的表面標(biāo)志表達(dá)水平同成人BMSCs一致；隨著體外傳代的增加,CD49f+細(xì)胞比例呈下降趨勢,且這種下降是由于CD49f本身降低所至；CD49f+細(xì)胞亞群的克隆形成和分化能力均強于CD49f-細(xì)胞。2.CD49f與炎癥因子對BMSCs生物學(xué)特性的影響方法：以BMSCs體外培養(yǎng)過程中加入不同種類和濃度的炎癥因子進(jìn)行刺激為模型,利用流式細(xì)胞術(shù)、Real-Time PCR和Western Blot的方法檢測CD49f的改變情況；檢測炎癥因子對BMSCs分化能力的影響,通過將CD49f敲減和過表達(dá)驗證其在BMSCs分化能力維持中的作用；采用細(xì)胞粘附實驗檢測BMSCs對CD49f配體laminin的粘附能力及炎癥因子對其的影響,通過功能性封閉性抗體驗證CD49f在其中發(fā)揮的作用；應(yīng)用免疫共沉淀篩選CD49f結(jié)合蛋白,并探討其與BMSCs炎癥環(huán)境下粘附和遷移等行為的關(guān)系。結(jié)果：TNF-α處理BMSCs后可導(dǎo)致CD106的上調(diào)和CD49f的下調(diào),其中CD49f異構(gòu)體A的下降作用明顯,而異構(gòu)體B則無顯著改變；而TGF-β1則可下調(diào)CD106的表達(dá),對CD49f無明顯影響；TNF-α降低BMSCs的成骨成脂分化能力,CD49f特別是異構(gòu)體A的過表達(dá)可促進(jìn)BMSCs的分化能力,CD49f敲減后其分化能力相應(yīng)減弱；CD49f介導(dǎo)BMSCs與laminin的粘附,TNF-α誘導(dǎo)的CD49f下降可使BMSCs與laminin的粘附能力減弱；TNF-α誘導(dǎo)BMSCs遷移能力增加,TG2可與CD49f特異性結(jié)合,且TNF-α處理后TG2表達(dá)升高。3. TNF-α調(diào)控CD49f表達(dá)的機制方法：加入TNF-α刺激BMSCs后在不同時間點收集細(xì)胞,應(yīng)用western blot、免疫熒光及免疫細(xì)胞化學(xué)的方法檢測NF-κB和mTOR信號通路中各級分子的活化情況；分別應(yīng)用NF-κB特異性抑制劑SN50及mTOR抑制劑rapamycin和PP242預(yù)處理BMSCs后再進(jìn)行TNF-α刺激,通過檢測關(guān)鍵分子的活化情況判斷相應(yīng)信號通路是否被特異性抑制；同時,應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測上述抑制劑預(yù)處理的BMSCs經(jīng)TNF-α刺激后以及正常培養(yǎng)傳代過程中CD49f的改變情況,以判斷何種信號通路在CD49f的調(diào)控中發(fā)揮關(guān)鍵作用。結(jié)果：TNF-α處理后BMSCs中NF-κB和mTOR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路均被活化；SN50可特異性抑制TNF-α誘導(dǎo)的NF-κB p65的核移位,rapamycin和PP242可特異性抑制mTOR及其下游效應(yīng)分子S6K1及AKT的活化；rapamycin和PP242預(yù)處理的BMSCs中TNF-α誘導(dǎo)的CD49f下降明顯減弱,而SN50則無此作用；此外,rapamycin和PP242還可抑制體外傳代過程中CD49f的下降。研究結(jié)論：1.CD49f在胎兒時期BMSCs中的表達(dá)遠(yuǎn)多于成人BMSCs; CD49f對環(huán)境變化敏感,體外培養(yǎng)使其呈下降趨勢；以CD49f為表面標(biāo)志分選的CD49f+BMSCs克隆形成及分化能力強于CD49f-細(xì)胞,CD49f可做為BMSCs的干性標(biāo)志。2. TNF-α以濃度依賴性的方式使BMSCs中CD49f下降,CD49f的下降與炎癥環(huán)境下BMSCs分化能力的減弱密切相關(guān)；CD49f介導(dǎo)BMSCs粘附于laminin,CD49f可與TG2特異性結(jié)合；TNF-α處理的BMSCs與laminin粘附能力減弱,而跨膜遷移能力的增加,這種變化與CD49f的下降和TG2的升高密切相關(guān)。3. TNF-α可引起B(yǎng)MSCs中NF-κB和mTOR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活化,相應(yīng)信號通路的抑制劑對TNF-α誘導(dǎo)的BMSCs中NF-κB和mTOR信號通路的活化具有抑制作用；但是僅有mTOR信號通路抑制劑rapamycin口PP242可抑制TNF-α誘導(dǎo)的CD49f下降,說明mTOR在CD49f的調(diào)控中具有重要作用。4.CD49f作為BMSCs干性表面標(biāo)志的確立為臨床疾病治療中MSCs的選擇提供了一種新的分選標(biāo)志；CD49f在炎癥因子所致BMSCs生物學(xué)特性改變過程中的重要作用對于闡明炎癥對干細(xì)胞的影響具有重要意義；此外,鑒于mTOR在CD49f調(diào)控中的重要性,mTOR抑制劑的應(yīng)用可能為體內(nèi)炎癥環(huán)境下BMSCs的保護(hù)以及體外培養(yǎng)過程中BMSCs干性的維持建立一種有效的干預(yù)手段。
【學(xué)位單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：R329.2
【部分圖文】：

油紅０染色脂滴顯示為紅色。低倍鏡下觀察ＣＤ４９ｆ＋細(xì)胞油紅０染色區(qū)域遠(yuǎn)較??ＣＤ４９ｆ－細(xì)胞組分布密集：應(yīng)用軟件對紅色區(qū)域進(jìn)行定量后進(jìn)一步顯示ＣＤ４９ｆ＋細(xì)胞??組成脂水平高于ＣＤ４９ｆ－細(xì)胞組。與成脂情況類似，經(jīng)成骨誘導(dǎo)１４天后，茜素紅染??色Ｗ及定量結(jié)果顯示ＣＤ４９ｆ＋細(xì)胞組巧結(jié)節(jié)數(shù)量及整體面積遠(yuǎn)多于ＣＤ４９ｆ－細(xì)胞組??（圖５），說明ＣＤ４９ｆ＋細(xì)胞擁有較強的分化能力。??

?？?ＣＤ４９ｆ?Ｉ?＞■?ＣＤ４９ｆ??圖３．?Ｆ－ＢＭＳＣｓ連續(xù)傳代過程中ＣＤ４９ｆ表達(dá)的流式檢測??Ａ：?Ｐ２－Ｐ１０不同代數(shù)Ｆ－ＢＭＳＣｓＣＤ４９ｆ的表達(dá)；Ｂ；?ＣＤ４９ｆ＋和ＣＤ４９ｆ－細(xì)胞流式細(xì)胞儀分選及培??養(yǎng)后ＣＤ４９ｆ的變化情況。??ＣＤ４９ｆ＋?ＣＤ４９ｆ－?？助?．？．??？？化Ａ??國４．?ＣＤ４９ｆ＋和ＣＤ４９ｆ－細(xì)胞克隆形成能力的比較??ＣＤ４９ｆ＋及ＣＤ４９ｆ－ＢＭＳＣｓ經(jīng)分選后進(jìn)行克隆形成實驗，并對形成的克隆比例進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。：??＊?表示?Ｐ?＜０．０５。??ＣＤ４９ｆ＋?ＣＤ４９ｆ－??

?？?■Ｄ４９圖３．?Ｆ－ＢＭＳＣｓ連續(xù)傳代過程中ＣＤ４９ｆ表達(dá)的流式檢測??Ａ：?Ｐ２－Ｐ１０不同代數(shù)Ｆ－ＢＭＳＣｓＣＤ４９ｆ的表達(dá)；Ｂ；?ＣＤ４９ｆ＋和ＣＤ４９ｆ－細(xì)胞流式細(xì)胞儀分選及培??養(yǎng)后ＣＤ４９ｆ的變化情況。??
【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 張翼鷟;達(dá)萬明;趙丹丹;唐菊英;;人間充質(zhì)干細(xì)胞Stro-1~+和Stro-1~-亞群免疫抑制作用差異的體外研究[J];解放軍醫(yī)學(xué)雜志;2007年10期

2 李芳;郭青;張翼;趙丹丹;許雯;夏冰;;間充質(zhì)干細(xì)胞和Stro-1~+亞群免疫抑制的比較及IDO1、IDO2在其中的作用[J];天津醫(yī)科大學(xué)學(xué)報;2012年02期

本文編號：2837606