單核細(xì)胞增生性李斯特氏菌(Listeria moncytogenes,Lm)是一種重要的食源性病原菌,由于其具有分布廣、耐受力強(qiáng)、高致病力等特點(diǎn)而備受食品安全領(lǐng)域關(guān)注。為了探明保定、石家莊及周邊地區(qū)食源性單增李斯特菌的污染狀況;探明該地區(qū)食源性單增李斯特菌的遺傳多態(tài)性;了解食源性單增李斯特菌的毒力基因分布狀況、毒力基因在其生長周期中不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)規(guī)律、在不同宿主條件下毒力基因表達(dá)水平以及食源性單增李斯特菌的致病力等情況。本研究對從保定、石家莊及周邊地區(qū)農(nóng)貿(mào)市場、超市采集七大類食品共1288個(gè)樣品進(jìn)行單增李斯特菌的污染調(diào)查;對鑒定分離出的308株食源性單增李斯特菌的27個(gè)毒力基因的分布情況進(jìn)行了PCR檢測;采用RAPD法對308株食源性單增李斯特菌的遺傳多態(tài)性進(jìn)行分析,并采用不加權(quán)成對算數(shù)平均法(UPAMA)進(jìn)行聚類分析;采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)(q RT-PCR)對其主要毒力基因的表達(dá)量進(jìn)行了時(shí)序性表達(dá)研究;采用天然肉湯培養(yǎng)及熒光定量PCR分析法對單增李斯特菌在不同宿主條件下主要毒力基因表達(dá)水平進(jìn)行研究;采用小鼠毒力實(shí)驗(yàn)對一些毒力基因缺失株單增李斯特菌進(jìn)行致病力實(shí)驗(yàn)。通過本研究得到如下結(jié)論:(1)通過對保定、石家莊地區(qū)七大類食品中單增李斯特菌的污染調(diào)查表明:單增李斯特菌在該地區(qū)食品中的平均檢出率為23.91%,其中生肉高達(dá)40.60%,熟肉制品和水產(chǎn)品分別達(dá)到25.42%和23.46%,而其他食品中較少;動(dòng)物源食品檢出率高于植物源食品。(2)優(yōu)化并建立了單增李斯特菌的RAPD分型方法,得出了308株食源性單增李斯特菌的DNA指紋圖譜,根據(jù)菌株之間的親緣關(guān)系制作食源性單增李斯特菌的遺傳進(jìn)化樹;(3)通過對308株食源性單增李斯特菌的RAPD遺傳多態(tài)性分析,可將308株單增李斯特菌分成6個(gè)基因類群,其中第Ⅱ聚類和第I聚類為保定、石家莊地區(qū)的優(yōu)勢種群;食源性單增李斯特菌具有一定的寄主偏好性,其傳播流行具有明顯的時(shí)間性和地域性;(4)通過對七大類食品中308株單增李斯特菌分離株中的27個(gè)毒力基因的PCR檢測發(fā)現(xiàn):與侵入、感染有關(guān)的毒力基因在動(dòng)物源食品分離株中分布明顯高于植物源食品分離株中;與黏附、調(diào)控有關(guān)的毒力基因在兩者中差別不明顯;該地區(qū)屬于Ⅰ型的單增李斯特菌其毒力基因的平均含量要高于Ⅱ型的菌株;該地區(qū)食源性單增李斯特菌分離株中hfq、dlt C和iap檢出率最高,可作為該地區(qū)食源性單增李斯特菌鑒定的參考基因;(5)單增李斯特菌的毒力基因表達(dá)量在菌體生長的穩(wěn)定期后期(16 h~18 h)達(dá)到高峰,以后表達(dá)量逐漸降低,但直到菌體生長衰亡期仍保持較高表達(dá)量;在豬、雞、牛、羊四種肉湯培養(yǎng)基中毒力基因表達(dá)水平差異明顯,表明單增李斯特菌在不同宿主條件下其毒力基因表達(dá)量不同;(6)毒理試驗(yàn)結(jié)果表明:hly A基因?qū)卧隼钏固鼐闹虏×哂袥Q定性作用,inl A、prf A和vir R基因?qū)卧隼钏固鼐闹虏×τ绊戄^大,而plc A,act A、plc B、dlt A、dlt D等基因?qū)卧隼钏固鼐虏×杏绊懙鄬^小。本論文研究成果將為食源性單增李斯特菌的預(yù)防、檢測、溯源以及食品安全提供重要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和理論支持。
【學(xué)位單位】：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：TS201.3
【文章目錄】：
中文摘要
英文摘要
引言
    1 國內(nèi)外研究現(xiàn)狀
        1.1 單增李斯特菌的生物學(xué)特征
        1.2 單增李斯特菌的傳染與危害
        1.3 單增李斯特菌的檢測方法研究
            1.3.1 傳統(tǒng)的分離鑒定方法
            1.3.2 基于免疫學(xué)檢測方法
            1.3.3 分子生物學(xué)檢測方法
        1.4 單增李斯特菌的分型方法研究
        1.5 單增李斯特菌的毒理機(jī)制研究
            1.5.1 粘附侵襲相關(guān)毒力因子
            1.5.2 細(xì)胞內(nèi)感染相關(guān)毒力因子
            1.5.3 毒力調(diào)控因子
            1.5.4 環(huán)境耐受因子
    2 研究目和意義以及研究內(nèi)容
        2.1 目的意義
        2.2 研究內(nèi)容
            2.2.1 保定、石家莊地區(qū)食源性單增李斯特菌的污染水平調(diào)查
            2.2.2 食源性單增李斯特菌的遺傳多樣性的RAPD分析
            2.2.3 食源性單增李斯特菌的毒理機(jī)制研究
        2.3 本研究技術(shù)路線
第一章 食源性單核增生性李斯特氏菌的食品污染調(diào)查
    1 材料與方法
        1.1 試驗(yàn)材料
            1.1.1 標(biāo)準(zhǔn)菌株
            1.1.2 試驗(yàn)樣品
            1.1.3 試劑及耗材
            1.1.4 主要儀器
        1.2 試驗(yàn)方法
            1.2.1 單增李斯特菌分離鑒定方法
            1.2.2 單增李斯特菌分離多重PCR驗(yàn)證方法
            1.2.3 單增李斯特菌基因組DNA的提取
            1.2.4 引物合成
            1.2.5 PCR反應(yīng)條件
    2 結(jié)果與分析
        2.1 單增李斯特菌分離鑒定
            2.1.1 形態(tài)鑒定結(jié)果
            2.1.2 生化鑒定結(jié)果
            2.1.3 多重PCR鑒定結(jié)果
        2.2 單增李斯特菌分離株的來源及分布
    3 小結(jié)
第二章 食源性單核增生性李斯特氏菌遺傳多樣性的RAPD分析
    1 材料與方法
        1.1 試驗(yàn)材料
        1.2 試驗(yàn)方法
            1.2.1 隨機(jī)引物設(shè)計(jì)及選擇
            1.2.2 DNA提取
            1.2.3 RAPD優(yōu)化的反應(yīng)條件
            1.2.4 RAPD擴(kuò)增產(chǎn)物條帶統(tǒng)計(jì)及數(shù)據(jù)處理
    2 結(jié)果與分析
        2.1 食源性單增李斯特菌RAPD擴(kuò)增結(jié)果
        2.2 308 株單增李斯特菌株的聚類分析
        2.3 RAPD-PCR的重復(fù)性
    3 討論
    4 小結(jié)
第三章 食源性單核增生性李斯特氏菌的毒理機(jī)制研究
    第一節(jié) 食源性單增李斯特菌主要毒力基因的PCR檢測及分布研究
        1 材料與方法
            1.1 試驗(yàn)材料
            1.2 試驗(yàn)方法
                1.2.1 單增李斯特菌的活化及培養(yǎng)
                1.2.2 單增李斯特菌基因組DNA的提取
                1.2.3 毒力基因的引物設(shè)計(jì)與合成
                1.2.4 PCR反應(yīng)條件
                1.2.5 PCR產(chǎn)物回收、測序及同源性比對
        2 結(jié)果與分析
            2.1 二十七個(gè)毒力基因引物特異性驗(yàn)證
            2.2 食源性單增李斯特菌毒力基因的PCR檢測
                2.2.1 iap基因的PCR檢測（擴(kuò)增片段為 528 bp）
                2.2.2 inl（內(nèi)化素）基因家族（又稱為LIPI-2 毒力島）的PCR檢測
                2.2.3 第一毒力島（LIPI-1）基因的PCR檢測
                2.2.4 ami基因的PCR檢測（擴(kuò)增片段大小為 241 bp）
                2.2.5 fbp基因的PCR檢測（擴(kuò)增片段大小為 471 bp）
                2.2.6 hpt基因的PCR檢測（擴(kuò)增片段大小為 575 bp）
                2.2.7 bsh基因的PCR檢測（擴(kuò)增片段大小為 340bp）
                2.2.8 gadA基因的PCR檢測（擴(kuò)增片段大小為 544 bp）
                2.2.9 hfq基因的PCR檢測（擴(kuò)增片段大小為 207 bp）
                2.2.10 virR基因的PCR檢測（擴(kuò)增片段大小為 210 bp）
                2.2.11 mprF基因的PCR檢測（擴(kuò)增片段大小為 222 bp）
                2.2.12 dlt操縱子各基因的PCR鑒定（dltA、dltB、dltC、dltD的擴(kuò)增片段長度分別為 277bp、                286bp、113bp、287bp）
                2.2.13 PCR產(chǎn)物序列測定及同源性比較
            2.3 27 個(gè)毒力基因在不同食品源單增李斯特菌中的分布
            2.4 27 個(gè)毒力基因在不同基因聚類的單增李斯特菌中的分布
        3 討論
        4 小結(jié)
    第二節(jié) 食源性單增李斯特菌Lm319 主要毒力基因的時(shí)序性表達(dá)研究
        1 材料和方法
            1.1 試驗(yàn)材料
            1.2 試驗(yàn)方法
                1.2.1 單增李斯特菌的活化及培養(yǎng)
                1.2.2 單增李斯特菌基因組DNA的提取
                1.2.3 單增李斯特菌基因組RNA的提取
                1.2.4 毒力基因的引物設(shè)計(jì)與合成
                1.2.5 PCR反應(yīng)條件
                1.2.6 cDNA第一條鏈合成
                1.2.7 RT-qPCR反應(yīng)
                1.2.8 數(shù)據(jù)處理
        2 結(jié)果與分析
            2.1 單增李斯特菌Lm319 生長曲線測定
            2.2 單增李斯特菌Lm319 中毒力基因的PCR檢測
            2.3 單增李斯特菌Lm319 毒力基因時(shí)序性表達(dá)的定性檢測
            2.4 單增李斯特菌Lm319 毒力基因時(shí)序性表達(dá)的實(shí)時(shí)定量測定
        3 討論
        4 小結(jié)
    第三節(jié) 食源性單增李斯特菌Lm319 的毒力基因在四種肉湯培養(yǎng)基中表達(dá)分析
        1 材料和方法
            1.1 實(shí)驗(yàn)材料
            1.2 試驗(yàn)方法
                1.2.1 單增李斯特菌的活化
                1.2.2 四種肉湯培養(yǎng)基制作
                1.2.3 四種肉湯培養(yǎng)基中單增李斯特菌的培養(yǎng)
                1.2.4 單增李斯特菌基因組DNA的提取
                1.2.5 單增李斯特菌基因組RNA的提取
                1.2.6 毒力基因的引物設(shè)計(jì)與合成
                1.2.7 cDNA第一條鏈合成
                1.2.8 PCR反應(yīng)條件
                1.2.9 RT-qPCR反應(yīng)
                1.2.10 數(shù)據(jù)處理
        2 結(jié)果與分析
            2.1 四種肉湯培養(yǎng)基中單增李斯特菌Lm319 毒力基因RT-PCR檢測
            2.2 四種肉湯培養(yǎng)基中單增李斯特菌Lm319 毒力基因定量測定
        3 小結(jié)
    第四節(jié) 食源性單增李斯特菌的致病力研究
        1 材料和方法
            1.1 實(shí)驗(yàn)材料
            1.2 試驗(yàn)方法
        2 結(jié)果與分析
            2.1 試驗(yàn)小鼠的選擇
            2.2 注射計(jì)量的選擇
            2.3 不同基因聚類的單增李斯特菌致病力比較
            2.4 不同毒力基因?qū)π∈笾虏×τ绊?br>                2.4.1 inlA基因?qū)π∈笾虏×τ绊?br>                2.4.2 plcA，actA和plcB基因?qū)π∈笾虏×τ绊?br>                2.4.3 prfA基因?qū)π∈笾虏×τ绊?br>                2.4.4 hlyA基因?qū)π∈笾虏×τ绊?br>                2.4.5 virR，dltA和dltD基因?qū)π∈笾虏×τ绊?br>        3 討論
        4 小結(jié)
結(jié)論與展望
    1 全文結(jié)論
    2 展望
附件一：毒力基因的序列測定結(jié)果
附件二：毒力基因的檢測結(jié)果統(tǒng)計(jì)表
參考文獻(xiàn)
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致謝

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本文編號：2837231