本文關(guān)鍵詞：三價(jià)金屬離子及其配合物對(duì)MMPs抑制作用及機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）是由細(xì)胞分泌的含有鋅金屬離子催化中心的肽鏈內(nèi)切酶。MMPs除了能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）和基底膜外，它們?cè)谡{(diào)控細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、激素和細(xì)胞粘附分子受體等的合成和分泌中發(fā)揮重要作用，進(jìn)而參與發(fā)育、進(jìn)化、形態(tài)發(fā)生、組織重塑、血管新生、關(guān)節(jié)炎、心血管疾病、中風(fēng)、多發(fā)性硬化癥、神經(jīng)退行性疾病、過(guò)敏以及癌癥等一系列生理和病理過(guò)程。其中MMP-2、-13、-14分別屬于明膠酶類、膠原酶類以及膜型MMPs，它們具有不同的底物降解特異性，能夠降解不同類型膠原和明膠，參與了需要ECM重塑的多個(gè)生理或病理過(guò)程，其過(guò)量表達(dá)與腫瘤惡化過(guò)程中癌細(xì)胞的遷移、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。 金屬離子在許多生物過(guò)程中發(fā)揮重要作用，如細(xì)胞呼吸、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、存儲(chǔ)和新陳代謝。作為催化酶或維持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能的活性中心發(fā)揮生物功能。破壞金屬離子體內(nèi)平衡涉及很多疾病。但金屬藥物在臨床用于治療各種疾病。并且隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)三價(jià)金屬及配合物如瀾系等具有多種生理功能，并且具有抗菌、抗病毒、抗癌活性。 在前期工作中，我們對(duì)關(guān)白附中抑制MMPs的有效成分研究中發(fā)現(xiàn)，NH4Al(SO4)212H2O對(duì)MMP-2、-9抑制的IC501μM，而(NH4)2SO4，K2SO4對(duì)MMPs無(wú)明顯抑制，推斷其抑制作用的活性基團(tuán)是三價(jià)鋁。同時(shí)，在對(duì)細(xì)胞的存活能力不產(chǎn)生影響的濃度下，NH4Al(SO4)212H2O顯示了對(duì)HT-1080細(xì)胞浸潤(rùn)和遷移能力的劑量依賴性抑制。我們進(jìn)而分析了幾種三價(jià)的金屬離子、三價(jià)金屬的配合物如Fe2(SO4)3、FeCl3、NH4Fe(SO4)2以及K3[Fe(CN)6]對(duì)MMP-16的抑制作用，發(fā)現(xiàn)這幾種三價(jià)金屬鹽或其配合物對(duì)MMP-16的活性、細(xì)胞的遷移和侵襲能力均有比較顯著的影響。在這些發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討眾多三價(jià)金屬離子、三價(jià)金屬離子的配合物對(duì)MMPs的抑制是否具有普遍性、對(duì)MMPs家族成員的抑制是否具有特異性、抑制MMPs活性的分子機(jī)制、對(duì)其它蛋白酶家族的成員是否也存在一定的抑制作用，這是本論文試圖回答或部分回答的主要問(wèn)題。 在本研究中，我們選擇了12種具有代表性的三價(jià)金屬離子及其配合物，分析了對(duì)三種不同類型的重組MMPs，MMP-2、-13、-14的抑制作用。結(jié)果表明，瀾系的LaCl3、TbCl3、GdCl3、YbCl3、EuCl3對(duì)MMP-2、-13以及-14均有不同程度的抑制作用，IC5010μM左右。K3[Fe(CN)6]、FeCl3、AlCl3、NH4Al(SO4)212H2O四種試劑對(duì)三種MMPs的酶活抑制IC5010μM，，K3[Fe(CN)6]抑制效果尤為顯著，IC50分別為2.2μM、0.88μM、0.05μM。其他三價(jià)金屬離子化合物YCl3、HAuCl4、NaAuCl4對(duì)的三種MMPs的IC5010μM，HAuCl4對(duì)MMP-14抑制效果尤為顯著，IC50值為0.3μM。同時(shí)，終濃度為10μM的K3[Fe(CN)6]、FeCl3、AlCl3、NH4Al(SO4)2、LaCl3、EuCl3、TbCl3、GdCl3、YCl3、YbCl3、HAuCl4、NaAuCl4對(duì)Cathepsin （組織蛋白酶）K、L均無(wú)明顯抑制，但對(duì)于Cathepsin B有抑制，而K3[Fe(CN)6]與HAuCl4對(duì)上述三種Cathepsin均無(wú)明顯抑制。另外，我們發(fā)現(xiàn)CaCl2、NiCl2、MnCl2、ZnSO4、CoCl2、NiCl2等二價(jià)金屬離子在100μM對(duì)三種MMPs并不抑制。上述結(jié)果表明，三價(jià)金屬及其配合物對(duì)MMPs具有普遍的抑制作用，而K3[Fe(CN)6]與HAuCl4對(duì)MMPs家族的MMP-14具有特異性抑制作用。另外，三價(jià)金屬及配合物對(duì)HT-1080細(xì)胞活力的作用分析表明，F(xiàn)eCl3、AlCl3、NH4Al(SO4)212·H2O、LaCl3、EuCl3、TbCl3、GdCl3、YCl3、YbCl3降低細(xì)胞活性的IC50值均大于350μM。并且，我們發(fā)現(xiàn)在0-350μM隨著化合物濃度的增加，并沒有明顯的細(xì)胞毒趨勢(shì)，而濃度大于350μM時(shí)，細(xì)胞活力驟然降低，推測(cè)可能是由于細(xì)胞對(duì)于這些三價(jià)離子的通透性突然增強(qiáng)，從而進(jìn)入細(xì)胞中最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡，細(xì)胞活力下降。 我們隨后選取了對(duì)MMP-14具有特異性抑制，并且抑制效果較強(qiáng)的K3[Fe(CN)6]，分析了其對(duì)MMP-14抑制機(jī)制及抑制類型。并進(jìn)一步檢測(cè)了K3[Fe(CN)6]對(duì)腫瘤細(xì)胞行為的影響，最后對(duì)調(diào)節(jié)細(xì)胞行為的機(jī)制進(jìn)行了初步探討。酶動(dòng)力學(xué)分析表明，K3[Fe(CN)6]在終濃度0-0.06μM范圍內(nèi)對(duì)MMP-14的抑制為可逆抑制機(jī)制。通過(guò)Michaelis-Menten方程、Lineweaver-Burk方程以及Dixonplots作圖表明，當(dāng)抑制濃度為0.0157μM時(shí)，Km不變，Vmax變小，屬于非競(jìng)爭(zhēng)性抑制，但隨著濃度增加為0.0313μM、0.0625μM時(shí)Km變小，Vmax變小，屬于非競(jìng)爭(zhēng)與反競(jìng)爭(zhēng)混合型抑制類型。表明底物和抑制劑可以同時(shí)與酶結(jié)合，形成的中間三元復(fù)合物影響酶的構(gòu)象和催化能力，因此酶活力降低。同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)了K4[Fe(CN)6]對(duì)MMP-14具有顯著地抑制作用以及一致抑制機(jī)制，比較其他活性基團(tuán)發(fā)現(xiàn)抑制的活性中心為Fe-CN的配合物。進(jìn)一步細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，在不影響細(xì)胞活力的濃度下，K3[Fe(CN)6](0-50μM)對(duì)腫瘤細(xì)胞HT-1080的遷移和侵襲具有顯著抑制作用。免疫印跡實(shí)驗(yàn)表明，0-50μM的K3[Fe(CN)6]抑制細(xì)胞的浸潤(rùn)和遷移，可能與對(duì)MMP-14表達(dá)的下調(diào)相關(guān)。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明，K3[Fe(CN)6]對(duì)HT-1080細(xì)胞中Erk1/2、-catenin、P-JNK、FAK蛋白表達(dá)下調(diào)，推測(cè)可能是通過(guò)對(duì)上述的蛋白調(diào)控，進(jìn)而抑制了細(xì)胞的遷移和侵潤(rùn)。具體的調(diào)控機(jī)制與信號(hào)傳遞有待進(jìn)一步研究。 最后，我們針對(duì)HAuCl4對(duì)MMP-14的特異性抑制機(jī)制及類型進(jìn)行了分析。并進(jìn)一步分析了其對(duì)腫瘤細(xì)胞行為的影響。結(jié)果表明，HAuCl4對(duì)MMP-14的抑制機(jī)制為可逆抑制。Michaelis-Menten方程作圖以及Lineweaver-Burk方程和Dixon plots作圖表明，隨著濃度增加，Km不變，Vmax變小，HAuCl4在0-0.6μM濃度范圍內(nèi)對(duì)MMP-14抑制屬于非競(jìng)爭(zhēng)抑制，即底物和HAuCl4對(duì)MMP-14的作用不存在競(jìng)爭(zhēng)的關(guān)系，MMP-14與底物或者HAuCl4結(jié)合都不影響與另外一個(gè)的結(jié)合，形成的中間三元復(fù)合物可能影響酶的構(gòu)象和催化能力，因此導(dǎo)致酶活力降低。并且作用的部位為活性部位以外的基團(tuán)，其結(jié)構(gòu)與底物無(wú)共同之處，不能通過(guò)增加底物濃度來(lái)解除抑制。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，HAuCl4在不影響細(xì)胞活力的濃度下0-50μM，對(duì)腫瘤的遷移和侵襲具有顯著抑制作用。提示HAuCl4可能通過(guò)抑制MMP-14活性進(jìn)而對(duì)腫瘤細(xì)胞行為起作用。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，NaAuCl4盡管也顯示對(duì)基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2、13、14具有抑制作用，并且對(duì)組織蛋白酶不抑制，但與HAuCl4相比抑制作用較弱，尤其是對(duì)MMP-14，失去了抑制的選擇性。另外，NaAuCl4對(duì)HT-1080細(xì)胞活力影響的IC50較高，在和HAuCl4同樣濃度下，表現(xiàn)出了促進(jìn)細(xì)胞侵襲的現(xiàn)象。對(duì)于造成這一差異的原因還需進(jìn)一步研究。 綜上所述，本論文首次發(fā)現(xiàn)并證實(shí)了，三價(jià)金屬離子及配合物對(duì)MMPs具有普遍的抑制作用，且抑制IC50在微摩爾級(jí)，這種抑制可能通過(guò)調(diào)節(jié)MMPs的功能進(jìn)而調(diào)節(jié)MMPs參與的相關(guān)生理病理性活動(dòng)。以往的MMPs抑制劑的研究都局限在有機(jī)分子的范圍內(nèi)，我們的發(fā)現(xiàn)對(duì)MMPs抑制劑研究范圍的擴(kuò)展具有重要的理論意義。并且其中K3[Fe(CN)6]和HAuCl4兩種化合物對(duì)MMP-14均具有特異性的抑制作用，抑制機(jī)制分別為非競(jìng)爭(zhēng)-反競(jìng)爭(zhēng)混合型可逆性抑制、非競(jìng)爭(zhēng)性抑制，表明兩者是通過(guò)與MMP的非活性中心結(jié)合，可能通過(guò)改變其結(jié)構(gòu)、構(gòu)象進(jìn)而實(shí)現(xiàn)抑制的，對(duì)此目前尚未有報(bào)道。最后我們還發(fā)現(xiàn)了K3[Fe(CN)6]與HAuCl4能夠?qū)δ[瘤細(xì)胞HT1080的細(xì)胞行為的影響，尤其是K3[Fe(CN)6]，可能通過(guò)抑制MMP-14的活性和表達(dá)以及腫瘤相關(guān)的多種信號(hào)蛋白而抑制腫瘤的遷移和侵襲。綜上，本論文的研究對(duì)于了解三價(jià)金屬離子及其配合物在調(diào)節(jié)MMPs的活性，調(diào)節(jié)MMPs參與的相關(guān)生理病理活動(dòng)中的作用具有重要的意義。
【關(guān)鍵詞】：基質(zhì)金屬蛋白酶 三價(jià)金屬離子及其配合物 抑制機(jī)制 腫瘤
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：Q55
【目錄】：

• 中文摘要4-8
• Abstract8-16
• 第一章 緒論16-50
• 1 基質(zhì)金屬蛋白酶16-38
• 1.1 基質(zhì)金屬蛋白酶家族簡(jiǎn)介16
• 1.2 基質(zhì)金屬蛋白酶結(jié)構(gòu)及分類16-19
• 1.3 MMPs 的活化與調(diào)控19-23
• 1.3.1 轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)19-21
• 1.3.2 酶原形式 MMPs 的活化21-22
• 1.3.3 MMPs 活性的激活與抑制22-23
• 1.4 MMPs 的生理與病理作用23-36
• 1.4.1 MMPs 的生理功能23-26
• 1.4.2 MMPs 與腫瘤26-31
• 1.4.3 MMPs 與非腫瘤相關(guān)疾病31-36
• 1.5 MMPs 抑制劑36-38
• 2 金屬離子及配合物38-47
• 2.1 金屬離子生物功能38-39
• 2.2 金屬離子與疾病39-40
• 2.3 金屬及其配合物藥物發(fā)展40-41
• 2.4 三價(jià)金屬及配合物41-47
• 2.4.1 鐵鋁及其配合物41-44
• 2.4.2 瀾系及其配合物的生物功能44-45
• 2.4.3 其他三價(jià)陽(yáng)離子化合物及其配合物45-47
• 3 本論文研究目的和策略47-50
• 第二章 材料與方法50-60
• 1 材料50-53
• 1.1 菌種與細(xì)胞株以及抗體50
• 1.2 儀器50
• 1.3 試劑50-53
• 1.3.1 包涵體分離純化試劑50-51
• 1.3.2 SDS-PAGE 電泳試劑51-52
• 1.3.3 銀染試劑52-53
• 1.3.4 包涵體處理試劑53
• 2 方法53-60
• 2.1 重組蛋白 MMP-2，-13，-14 的表達(dá)、純化及復(fù)性53-54
• 2.1.1 重組蛋白 MMP-2，-13，-14 的誘導(dǎo)表達(dá)53-54
• 2.1.2 包涵體的分離和洗滌54
• 2.1.3 包涵體的溶解54
• 2.1.4 重組蛋白 MMP-2，-13，-14 包涵體的純化54
• 2.2 金屬離子及其配合物對(duì) MMPs 酶活力影響54-55
• 2.2.1 金屬離子及其配合物對(duì) MMPs 活性的影響54-55
• 2.2.2 金屬離子及其配合物對(duì)組織蛋白酶 B、K、L 活性的影響4055
• 2.2.3 酶活性的抑制 IC50測(cè)定55
• 2.3 酶動(dòng)力學(xué)分析55-56
• 2.3.1 酶活性抑制機(jī)制分析55-56
• 2.3.2 抑制劑對(duì)酶的抑制類型分析56
• 2.4 細(xì)胞培養(yǎng)56-57
• 2.4.1 細(xì)胞復(fù)蘇56
• 2.4.2 細(xì)胞傳代56
• 2.4.3 細(xì)胞凍存56-57
• 2.5 細(xì)胞活力檢測(cè)（MTT 法）57
• 2.6 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)（劃痕法）57
• 2.7 細(xì)胞侵襲試驗(yàn)57-58
• 2.8 免疫印跡58-60
• 第三章 結(jié)果與討論60-104
• 1 三價(jià)金屬離子及其配合物對(duì)MMPs的抑制作用60-80
• 1.1 三價(jià)金屬及其配合物對(duì)重組蛋白酶 MMP-2、-13、-14 的 IC50測(cè)定60-76
• 1.1.1 重組蛋白酶 MMP-2、-13、-14 的活性鑒定60-62
• 1.1.2 幾種瀾系金屬化合物對(duì) MMP-2、-13、-14 酶活性抑制62-65
• 1.1.3 三價(jià)鐵及鋁化合物及其配合物對(duì) MMP-2、-13、-14 酶學(xué)抑制（IC50）65-68
• 1.1.4 其他三價(jià)金屬及其配合物對(duì) MMP-2、-13、-14 酶活性抑制（IC50）68-76
• 1.2 三價(jià)金屬離子及配合物對(duì) HT-1080 細(xì)胞活力的影響76-78
• 1.3 小結(jié)78-80
• 2 K_3[Fe(CN)_6]對(duì)MMP-14的抑制機(jī)制研究80-94
• 2.1 K_3[Fe(CN)_6]對(duì) MMP-14 的抑制機(jī)制與類型80-84
• 2.2 K_3[Fe(CN)_6]抑制 MMP-14 酶活力的活性基團(tuán)分析84
• 2.3 K_3[Fe(CN)_6]對(duì) HT-1080 細(xì)胞活力的影響84-86
• 2.4 K_3[Fe(CN)_6]對(duì) HT-1080 細(xì)胞遷移能力的影響86-87
• 2.5 K_3[Fe(CN)_6]對(duì) HT-1080 細(xì)胞侵襲能力的影響87-89
• 2.6 K_3[Fe(CN)_6]對(duì) HT1080 細(xì)胞中 MMP-14 表達(dá)的影響89-90
• 2.7 K_3[Fe(CN)_6]對(duì)多種細(xì)胞信號(hào)蛋白的影響90-92
• 2.8 小結(jié)92-94
• 3 HAuCl_4對(duì)MMP-14酶活性抑制作用及機(jī)制研究94-100
• 3.1 HAuCl_4對(duì) MMP-14 抑制機(jī)制與抑制類型94-96
• 3.2 HAuCl_4對(duì) HT-1080 細(xì)胞活力的影響96-98
• 3.4 HAuCl_4對(duì) HT-1080 細(xì)胞侵襲能力的影響98-99
• 3.5 小結(jié)99-100
• 4 結(jié)論100-104
• 參考文獻(xiàn)104-128
• 作者簡(jiǎn)介及攻讀博士期間所取得的科研成果128-130
• 致謝130

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：282566