本文關鍵詞：OsSPX4與OsSPX6調控水稻磷信號和磷平衡的功能研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：OsPHR2屬于MYB家族轉錄因子,是水稻缺磷響應的中心調控因子,缺磷條件下誘導一系列缺磷信號基因的表達。已有研究報道水稻體內的SPX蛋白能夠作為OsPHR2的抑制因子,抑制植物的磷饑餓響應。本研究著重揭示水稻中SPX家族的SPX4和SPX6協(xié)同調控水稻的磷信號和磷平衡的機制。研究發(fā)現(xiàn)SPX4的轉錄水平不受外界磷濃度的影響,而SPX6的表達受缺磷誘導且恢復供磷后表達水平迅速回落。SPX6的啟動子含有3個P1BS順式元件,PHR2能與三個位點結合從而直接調控SPX6對不同磷濃度的響應過程。SPX4在植物各個組織都有表達,而SPX6在植物的根中主要在主根和側根的生長點表達。亞細胞定位實驗證明SPX4和SPX6都屬于核質共定位蛋白,兩者的區(qū)別為SPX4在核仁沒有定位而SPX6在核仁有明顯定位。研究發(fā)現(xiàn)SPX4蛋白的C端173-199之間的氨基酸序列對于SPX4的進核是必須的。SPX4蛋白在缺磷條件下加速降解,且根和葉中蛋白降解趨勢基本一致,進一步研究證明SPX4的降解主要依賴于植物體內的磷濃度,同時發(fā)現(xiàn)SPX4蛋白的穩(wěn)定性跟C端具有很大的關系。SPX6蛋白行為與SPX4蛋白存在較大差異,葉片SPX6蛋白表現(xiàn)為缺磷降解,根中則受缺磷誘導。超量表達SPX4造成水稻葉片磷濃度顯著下降,根中無機磷積累,破壞植物體內的磷平衡,抑制植物生長。SPX6超表達同樣也對水稻的生長造成影響,導致葉片的磷濃度下降。SPX4和SPX6的超表達植株還影響了植物的缺磷響應。通過TALEN技術獲得了spx4和spx6突變體,分別獲得了SPX4蛋白175位點和177-179位點保守氨基酸缺失的突變體,SPX6在SPX結構域的第二個和第三個亞結構域之間81-84位點四個氨基酸缺失的突變體。spx4突變體表現(xiàn)為生長受到抑制,老葉葉尖出現(xiàn)早衰現(xiàn)象,葉片和根中無機磷明顯高于野生型,低磷水培苗磷中毒現(xiàn)象消失。spx6突變體同樣表現(xiàn)為生長受到抑制,根長變短,老葉葉尖出現(xiàn)早衰現(xiàn)象,葉片和根中無機磷積累。SPX4和SPX6的缺失均能誘導根毛的伸長,可能通過影響植物的系統(tǒng)磷信號部分模擬了PHR2增強表達的表型。通過雜交獲得spx4/spx6雙突突變體,表型觀察結果表明spx4/spx6生長抑制更加明顯,葉片積累的無機磷濃度明顯高于親本spx4和spx6突變體,具有加性效應,說明SPX4和SPX6可能協(xié)同參與調控水稻的系統(tǒng)磷信號。體外pull-down和酵母雙雜(Y2H)實驗證明SPX4和SPX6在體外能夠直接與PHR2結合,而突變形式的SPX4和SPX6均不能與PHR2直接互作。BiFC和Co-IP實驗進一步證明了SPX4和SPX6能夠在植物體內和PHR2互作,BiFC實驗還反映出SPX4和SPX6能夠顯著改變PHR2的亞細胞定位,進一步的煙草表皮細胞共定位實驗證實了該結論。EMSA結果表明SPX4和SPX6是通過和PHR2的C端(含有MYB結構域和CC結構域)互作導致PHR2失去結合P1BS的能力。雙基因過表達遺傳材料SPX4-Ov/PHR2-Ov和SPX6-Ov/PHR2-ov的表型分析表明SPX4和SPX6的超表達能夠回復PHR-Ov引起的磷超積累和缺磷響應基因的誘導表達,從遺傳學上進一步證明了SPX4以及SPX6與PHR2的互作關系,并且根據以上的研究結果提出SPX4和SPX6調控水稻根和地上部的缺磷響應的模型。綜上所述,本研究闡述了水稻中兩個含有SPX結構域的蛋白SPX4和SPX6在水稻缺磷響應中的功能和分子機制。在正常磷條件下SPX4和SPX6蛋白穩(wěn)定,兩者通過與PHR2互作改變PHR2的亞細胞定位或者在細胞核內直接阻止PHR2結合其順式元件使植物一系列缺磷響應基因維持在基礎水平；當植物處于缺磷條件下,隨著植物體內磷濃度的下降,SPX4和SPX6發(fā)生降解,釋放出的PHR2進入細胞核從而誘導植物的缺磷響應。本研究構建了SPX4和SPX6在水稻地上部和根中缺磷響應的調控模型,使SPX蛋白家族研究更為系統(tǒng)和完整,進一步完善了植物磷信號通路模型,并為開發(fā)磷高效吸收利用的植物新品種提供堅實的理論基礎。
【關鍵詞】：水稻(Oryza satival L.) SPX4 SPX6 PHR2 磷信號 磷平衡
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：Q943.2
【目錄】：

• 致謝11-12
• 縮略表12-13
• 摘要13-15
• Abstract15-17
• 第一章 文獻綜述17-31
• 1.1 引言17
• 1.2 酵母PHO通路17-21
• 1.2.1 轉錄因子Pho4和Pho218-19
• 1.2.2 Pho80-Pho85-Pho81復合物對Pho4的調控19-20
• 1.2.3 酵母磷轉運體20-21
• 1.3 植物磷饑餓信號途徑21-30
• 13.1 植物磷信號中心調控因子PHR以及其他的轉錄因子22-24
• 1.3.2 磷信號中的microRNA及其靶基因和非編碼RNA24-25
• 1.3.3 植物磷轉運體(Phosphate transporter)及其調控25-27
• 1.3.4 SPX結構域的蛋白分類與功能簡介27-30
• 1.4 本研究的目的和意義30-31
• 第二章 SPX4和SPX6的組織表達模式和對磷的響應31-50
• 2.1 引言31
• 2.2 材料與方法31-35
• 2.2.1 材料31
• 2.2.2 溶液培養(yǎng)實驗31-32
• 2.2.3 水稻根、葉總RNA的提取以及第一鏈cDNA合成32
• 2.2.4 水稻DNA的提取32-33
• 2.2.5 SPX6自身啟動子基因組融合GFP和GUS載體構建33
• 2.2.6 凍融法轉化農桿菌和農桿菌介導的水稻轉化33
• 2.2.7 RNA原位雜交33-34
• 2.2.8 GUS染色與顯微觀察34
• 2.2.9 SPX4和SPX6亞細胞定位34
• 2.2.10 EMSA凝膠阻滯34-35
• 2.2.11 水稻總蛋白提取以及Westren Bolt檢測35
• 2.2.12 煙草瞬時轉化35
• 2.3 結果與分析35-48
• 2.3.1 SPX4和SPX6轉錄水平的磷響應35-36
• 2.3.2 PHR2直接調控SPX6缺磷誘導36-38
• 2.3.3 不同供磷條件下SPX4蛋白融合GUS組織表達分析38-40
• 2.3.4 OsSPX6基因的表達模式分析40-42
• 2.3.5 SPX4蛋白亞細胞定位分析42-43
• 2.3.6 SPX6蛋白亞細胞定位分析43-45
• 2.3.7 SPX6蛋白水平的磷響應45-46
• 2.3.8 植物體內SPX4蛋白穩(wěn)定性依賴于磷濃度46-47
• 2.3.9 SPX4蛋白C端影響SPX4蛋白的穩(wěn)定性47-48
• 2.4 討論48-50
• 第三章 SPX4、SPX6超表達影響水稻磷平衡和磷響應50-59
• 3.1 引言50
• 3.2 材料與方法50-51
• 3.2.1 材料50
• 3.2.2 SPX6超表達遺傳材料發(fā)展50
• 3.2.3 水稻的遺傳轉化和陽性苗篩選50
• 3.2.4 RNA提取以及半定量分析50-51
• 3.2.5 Southern分析51
• 3.3 結果與分析51-58
• 3.3.1 SPX4超表達材料鑒定和水培生理表型及生理分析51-54
• 3.3.2 SPX6超表達材料鑒定和水培生理表型及生理分析54-56
• 3.3.3 SPX4和SPX6超表達對水稻缺磷響應的影響56-58
• 3.4 討論58-59
• 第四章 spx4和spx6突變影響水稻磷信號和磷平衡59-76
• 4.1 引言59
• 4.2 材料與方法59-65
• 4.2.1 材料59
• 4.2.2 TALEN原理59-60
• 4.2.3 OsSPX4和OsSPX6 TALEN載體構建60-63
• 4.2.4 水稻轉基因以及T_0代轉基因苗鑒定63-64
• 4.2.5 野生型、spx4、spx6、spx4/spx6和PHR2-Ov根毛觀察64
• 4.2.6 野生型、spx4、spx6、spx4/spx6和PHR2-Ov水培處理64
• 4.2.7 spx4和spx6表型回復實驗64-65
• 4.3 結果與分析65-75
• 4.3.1 SSA luciferase報告基因檢測TALEN序列活性65
• 4.3.2 spx4和spx6突變體的鑒定65-66
• 4.3.3 spx4和spx6突變體水培表型和磷養(yǎng)分分析66-69
• 4.3.4 spx4、spx6、spx4/spx6和PHR2-Ov的根毛觀察69-70
• 4.3.5 spx4/spx6雙突加性70-74
• 4.3.6 spx4、spx6表型回復實驗74-75
• 4.4 討論75-76
• 第五章 SPX4和SPX6調控磷信號的分子機制與模型76-92
• 5.1 引言76
• 5.2 材料與方法76-78
• 5.2.1 材料76
• 5.2.2 酵母雙雜交實驗76
• 5.2.3 蛋白原核表達以及體外pulldown實驗76-77
• 5.2.4 蛋白免疫共沉淀77
• 5.2.5 雙分子熒光互補實驗77
• 5.2.6 煙草雙熒光瞬時表達實驗77-78
• 5.2.7 EMSA凝膠阻滯實驗78
• 5.3 結果與分析78-90
• 5.3.1 SPX4和SPX6蛋白和PHR2的體外互作78-80
• 5.3.2 SPX4和SPX6蛋白和PHR2的在植物體內互作80-81
• 5.3.3 SPX4影響PHR2亞細胞定位81-82
• 5.3.4 SPX4和SPX6抑制PHR2的功能82-86
• 5.3.5 OsSPX4和OsSPX6與OsPHR2遺傳互作86-88
• 5.3.6 OsSPX4和OsSPX6在水稻缺磷響應中的調控模型88-90
• 5.4 討論90-92
• 第六章 結論與展望92-94
• 6.1 結論92-93
• 6.2 展望93-94
• 參考文獻94-108
• 附錄108-117
• 作者簡歷及博士期間發(fā)表的論文117

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1 鐘永嘉;OsSPX4與OsSPX6調控水稻磷信號和磷平衡的功能研究[D];浙江大學;2015年

  本文關鍵詞：OsSPX4與OsSPX6調控水稻磷信號和磷平衡的功能研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：282190