普魯蘭多糖是一種線性葡聚糖,由重復(fù)的麥芽三糖單位經(jīng)α-1,6糖苷鍵連接而成,是由短梗霉產(chǎn)生的水溶性同型胞外多糖,普魯蘭多糖中α-1,4糖苷鍵和α-I,6糖苷鍵相互交替,使其具有結(jié)構(gòu)上的彈性和較強(qiáng)的水溶性。普魯蘭多糖在食品、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)及化妝品等行業(yè)具有廣泛的應(yīng)用潛力。對(duì)100多株分離自紅樹林生態(tài)系統(tǒng)中的短梗霉菌株產(chǎn)胞外多糖能力進(jìn)行篩選后,發(fā)現(xiàn)產(chǎn)黑色素短梗霉P16菌株產(chǎn)胞外多糖的能力最高。P16菌株產(chǎn)胞外多糖最適培養(yǎng)基中的碳源和氮源分別為120 g/1蔗糖和3 g/l酵母粉。在搖瓶培養(yǎng)條件下,120小時(shí)內(nèi)胞外多糖濃度達(dá)65.3±2.1 g/l，細(xì)胞干重達(dá)18.7±0.38g/l。]0-1發(fā)酵罐分批發(fā)酵120小時(shí),胞外多糖濃度達(dá)67.4±4.5 g/l，菌體量達(dá)23.01±0.12g/l,總糖剩余1.1%,還原糖剩余0.078%,并且發(fā)酵過程中不產(chǎn)黑色素。P16菌株所產(chǎn)的胞外多糖經(jīng)過純化后,可以被普魯蘭酶有效地水解；紅外光譜檢測(cè)分析發(fā)現(xiàn),純化的胞外多糖與普魯蘭多糖標(biāo)準(zhǔn)品的峰型一致,說明P16菌株所產(chǎn)的胞外多糖為普魯蘭多糖。這是對(duì)分離自紅樹林生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)黑色素短梗霉高產(chǎn)普魯蘭多糖的首次報(bào)道。在接下來的研究中,為了有效轉(zhuǎn)化菊粉生產(chǎn)普魯蘭多糖,在P16菌株中高效表達(dá)了Kluyveromyces maximum KM菌株的INUI基因,通過對(duì)不同重組菌株利用菊粉產(chǎn)普魯蘭多糖能力的測(cè)定,發(fā)現(xiàn)重組菌株E136的菊粉酶酶活達(dá)40.92±1.08 U/ml,而原始菌株P(guān)16的菊粉酶酶活僅為7.57±0.29 U/ml；重組菌株EI36所產(chǎn)的菊粉酶大部分(99.27%)分泌到培養(yǎng)基中。利用含140 g/l菊粉的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行10-1發(fā)酵罐分批發(fā)酵,108小時(shí)內(nèi),普魯蘭多糖濃度達(dá)70.57±1.3g/l,菊粉酶活力于60小時(shí)達(dá)到最高,為42.03 U/ml,培養(yǎng)基中的菊粉被EI36菌株所產(chǎn)的菊粉酶有效地水解,大部分的還原糖被EI36菌株用于普魯蘭多糖的生產(chǎn)。P16菌株經(jīng)過以上的遺傳改造后,可以直接利用菊粉生產(chǎn)普魯蘭多糖。普魯蘭多糖合成酶基因PUL1與普魯蘭多糖的生物合成相關(guān),對(duì)P16菌株中PUL1基因進(jìn)行克隆及特征分析后發(fā)現(xiàn),PUL1基因的ORF長(zhǎng)592 bp,編碼178個(gè)氨基酸,含有]段長(zhǎng)55 bP的內(nèi)含子。PUL1基因的啟動(dòng)子中含有1個(gè)CAAT box,1個(gè)TATA box和1段5’-HGATAR-3'序列,該基因編碼的蛋白含有1段長(zhǎng)18個(gè)氨基酸的信號(hào)肽,5個(gè)N-糖基化位點(diǎn)。對(duì)PUL1基因進(jìn)行敲除后,發(fā)現(xiàn)敲除菌株DP108的普魯蘭多糖產(chǎn)量顯著下降,為34.66±0.34g/l,說明PULl基因與普魯蘭多糖的合成相關(guān)。GFP-PUL1融合蛋白表達(dá)后,位于酵母細(xì)胞中的液泡表面,說明普魯蘭多糖的生物合成發(fā)生在酵母細(xì)胞的胞質(zhì)中。在P16菌株中超表達(dá)了PUL1基因后,發(fā)現(xiàn)重組菌株G14所產(chǎn)的普魯蘭多糖濃度超過72.0g/1，而原始菌株P(guān)16在相同條件下的普魯蘭多糖濃度為67.4 g/1,說明普魯蘭多糖的產(chǎn)量由于普魯蘭合成酶基因的超表達(dá)而提高。純化后的普魯蘭多糖分子量為4.422 x 105g/mol,并且分子量分布范圍較窄。
【學(xué)位單位】：中國(guó)海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：Q936

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