【摘要】：背景與目的:支原體感染后所致的炎癥反應(yīng)是其引起病理?yè)p傷的重要因素。研究顯示,支原體的主要致炎物質(zhì)膜脂蛋白及其衍生物巨噬細(xì)胞活化脂肽2(Mycoplasma macrophage-activating lipopeptide-2,MALP-2)可激活人單核、巨噬細(xì)胞并誘導(dǎo)其分泌一系列促炎細(xì)胞因子和介質(zhì),從而參與支原體感染后的免疫應(yīng)答和病理?yè)p傷。血紅素氧合酶-1(Heme oxygenase-1,HO-1)是催化血紅素降解為Fe2+、一氧化碳和膽綠素的限速酶。HO-1及其產(chǎn)物對(duì)多種因素所致的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)具有調(diào)控作用。研究顯示,多種病原相關(guān)分子模式(Pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)作用于固有免疫系統(tǒng)后,可誘導(dǎo)單核-巨噬細(xì)胞及樹突狀細(xì)胞表達(dá)HO-1,從而發(fā)揮一定的免疫保護(hù)作用。本課題組前期研究也表明,MALP-2處理人單核細(xì)胞后,可激活核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2并增強(qiáng)HO-1的活性,從而在一定程度上負(fù)向調(diào)控環(huán)氧化酶-2(Cyclooxygenase-2,COX-2)的表達(dá),但其上游信號(hào)通路仍不明了。本研究旨在進(jìn)一步研究MALP-2誘導(dǎo)HO-1表達(dá)的調(diào)控機(jī)制及其對(duì)細(xì)胞因子分泌的影響。方法:(1)體外培養(yǎng)人單核細(xì)胞系THP-1,用Toll樣受體2(Toll-like receptor 2,TLR2)或TLR6中和抗體孵育1h,或轉(zhuǎn)染TLR2負(fù)顯性突變體(Dominant negative TLR2,DN-TLR2)或DN-TLR6,隨后用5ng/m L MALP-2刺激16h,Western blot觀察阻斷TLR2或TLR6后對(duì)HO-1蛋白表達(dá)的影響;構(gòu)建HO-1啟動(dòng)子報(bào)告基因p GL3-HO-1-luc質(zhì)粒,連同DN-TLR2或DN-TLR6轉(zhuǎn)染THP-1細(xì)胞,觀察MALP-2作用后HO-1啟動(dòng)子活性的改變情況,以證實(shí)TLR2和TLR6在介導(dǎo)HO-1表達(dá)中的作用;(2)MALP-2刺激THP-1細(xì)胞0~30min,Western blot分析c-Src的磷酸化情況;采用c-Src抑制劑PP1預(yù)處理細(xì)胞或轉(zhuǎn)染c-Src si RNA,觀察c-Src是否參與HO-1表達(dá);(3)THP-1細(xì)胞用MALP-2刺激0~20min,Western blot分析Bruton’s酪氨酸激酶(Bruton’s tyrosine kinase,Btk)的磷酸化;采用PP1處理細(xì)胞,或用si RNA干擾c-Src表達(dá),觀察其對(duì)Btk磷酸化的影響,以證實(shí)c-Src是否參與Btk的激活;隨后采用Btk抑制劑LFM-A13預(yù)處理THP-1細(xì)胞,觀察其對(duì)HO-1蛋白表達(dá)及啟動(dòng)子活性的影響,以證實(shí)Btk在介導(dǎo)HO-1表達(dá)中的作用;(4)MALP-2刺激細(xì)胞前采用My D88或Mal si RNA干擾其表達(dá),或采用DN-My D88或DN-Mal轉(zhuǎn)染細(xì)胞,觀察My D88和Mal對(duì)HO-1蛋白表達(dá)以及啟動(dòng)子活性的影響;(5)Western blot檢測(cè)MALP-2刺激細(xì)胞0~60min后Akt的磷酸化情況;采用PP1和LFM-A13預(yù)處理細(xì)胞,或用Mal、My D88 si RNA分別沉默其表達(dá),觀察MALP-2處理后Akt的磷酸化情況,以證實(shí)c-Src、Btk、Mal或My D88是否參與PI3K的激活;隨后采用PI3K抑制劑LY294002預(yù)處理細(xì)胞,觀察PI3K是否參與HO-1表達(dá);最后采用免疫共沉淀檢測(cè)MALP-2處理后能否誘導(dǎo)形成c-Src/Btk/Mal/My D88/p85α復(fù)合體,以證實(shí)其直接相互作用;(6)采用LY294002處理細(xì)胞或轉(zhuǎn)染My D88 si RNA,分別采用免疫熒光和凝膠遷移率實(shí)驗(yàn)觀察核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2的核轉(zhuǎn)位和DNA結(jié)合活性,以證實(shí)MALP-2能否通過PI3K或My D88激活Nrf2;(7)細(xì)胞經(jīng)MALP-2刺激前采用si RNA分別干擾HO-1或Nrf2的表達(dá),或采用HO-1抑制劑鋅原卟啉(Zinc protoporphyrin,Zn PP)處理,實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)TNF-α和IL-6 m RNA表達(dá),ELISA檢測(cè)TNF-α,IL-6,IL-10的分泌以及NF-κB的活性;構(gòu)建pc DNA3.1-HO-1表達(dá)質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染細(xì)胞使其過表達(dá)HO-1,或采用HO-1激動(dòng)劑鈷原卟啉(Cobalt protoporphyrin,Co PP)和萊菔硫烷(Sulforaphane,SFN)處理細(xì)胞,觀察誘導(dǎo)HO-1表達(dá)后對(duì)TNF-α和IL-1β的分泌及NF-κB活性的影響,以證實(shí)HO-1在負(fù)向調(diào)控細(xì)胞因子分泌中的作用。結(jié)果:(1)TLR2或TLR6中和抗體預(yù)處理細(xì)胞后,可明顯抑制MALP-2誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞表達(dá)HO-1;同時(shí),采用DN-TLR2或DN-TLR6轉(zhuǎn)染細(xì)胞也可下調(diào)HO-1蛋白表達(dá)及其啟動(dòng)子活性;(2)MALP-2可誘導(dǎo)c-Src磷酸化;采用c-Src抑制劑PP1預(yù)預(yù)處理,或采用c-Src si RNA干擾其表達(dá)后,HO-1表達(dá)降低;(3)MALP-2處理THP-1細(xì)胞5min內(nèi)即可誘導(dǎo)Btk磷酸化,10min后達(dá)到峰值,而PP1處理以及c-Src si RNA干擾后均可抑制Btk的磷酸化;此外,Btk抑制劑LFM-A13預(yù)處理后,HO-1蛋白表達(dá)以及其啟動(dòng)子活性顯著降低;(4)采用si RNA沉默My D88或轉(zhuǎn)染DN-My D88均不能下調(diào)HO-1表達(dá),而轉(zhuǎn)染Mal si RNA或DN-Mal可明顯抑制MALP-2誘導(dǎo)HO-1表達(dá);雖然轉(zhuǎn)染DN-My D88可輕度抑制HO-1啟動(dòng)子活性,但其抑制效應(yīng)明顯低于DN-Mal轉(zhuǎn)染組;(5)MALP-2刺激THP-1細(xì)胞5min后即可誘導(dǎo)Akt磷酸化,15min后到達(dá)峰值,c-Src和Btk抑制劑PP1和LFM-A13處理均可抑制其激活;RNA干擾Mal表達(dá)后,Akt磷酸化顯著降低并將其低水平維持至120min以上。而轉(zhuǎn)染My D88 si RNA并經(jīng)MALP-2刺激15min后,Akt磷酸化明顯降低,但60min后Akt磷酸化水平恢復(fù)正常;PI3K抑制劑LY294002預(yù)處理可明顯抑制MALP-2誘導(dǎo)HO-1表達(dá);此外,免疫共沉淀顯示,MALP-2處理10min后可誘導(dǎo)c-Src/Btk/Mal/My D88/p85α形成復(fù)合體;(6)MALP-2處理1h可明顯誘導(dǎo)Nrf2核轉(zhuǎn)位并結(jié)合至HO-1的抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant response element,ARE);PI3K抑制劑LY294002處理后,Nrf2核轉(zhuǎn)位以及DNA活性明顯降低,而轉(zhuǎn)染My D88 si RNA對(duì)Nrf2核轉(zhuǎn)位以及DNA結(jié)合無明顯影響;(7)RNA干擾HO-1或Nrf2表達(dá)可上調(diào)MALP-2誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞表達(dá)并分泌TNF-α及IL-6,同時(shí)能增強(qiáng)NF-κB的活性,但對(duì)IL-10分泌無明顯影響;采用HO-1抑制劑Zn PP處理也得到了類似結(jié)果;通過轉(zhuǎn)染pc DNA3.1-HO-1使THP-1細(xì)胞過表達(dá)HO-1,或采用Co PP和SFN誘導(dǎo)HO-1表達(dá),均可在一定程度上減少TNF-α和IL-1β分泌并下調(diào)NF-κB的活性。結(jié)論:(1)支原體MALP-2經(jīng)TLR2,6/c-Src/Btk/Mal/PI3K/Nrf2通路誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞表達(dá)HO-1;(2)HO-1可負(fù)向調(diào)控THP-1細(xì)胞分泌TNF-α和IL-1β。
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R375
【圖文】：

第 3 章 結(jié) 果第 3 章 結(jié)果2 經(jīng) TLR2 和 TLR6 誘導(dǎo) THP-1 細(xì)胞表達(dá) 抗體抑制 MALP-2 誘導(dǎo) THP-1 細(xì)胞表達(dá) HO-1究當(dāng)中，我們發(fā)現(xiàn) MALP-2 可誘導(dǎo) THP-1 細(xì)胞表面表達(dá) TLR2 和 TLR6 受體。為了觀察 TLR2 是否細(xì)胞刺激前先經(jīng) 10μg/mL TLR2 中和抗體處理 1h，16h，Western blot 結(jié)果顯示 TLR2 抗體處理后，與顯降低（圖 1-1）。

圖 1-2. TLR2 負(fù)顯性突變體抑制 HO-1 表達(dá)Donimant negative TLR2 inhibits MALP-2-induced HO-1ntly transfected with a dominant negative (DN)-TLR2. After ted with 5ng/mL of MALP-2 for another 16h. The cell lysatesS-PAGE for Western blot analysis of HO-1. Data shown rept experiments (means±SEM). *, P<0.05 for significant .抗體下調(diào) HO-1 表達(dá)主要經(jīng)TLR2和TLR6識(shí)別MALP-2。為了觀察TLR6細(xì)胞經(jīng) 1μg/mL TLR6 中和抗體預(yù)孵育后，再用 MA示 TLR6 中和抗體處理能抑制 HO-1 蛋白表達(dá)（圖

圖 1-3. TLR6 中和抗體下調(diào) HO-1 蛋白表達(dá)ALP-2 induced HO-1 expression is inhibited by TLR6 neutralizere seeded in 6 well plate and preincubated with anti-TLR6 (1mg/ed with MALP-2 (5ng/mL) for 16h. HO-1 protein expression w and then densitometric analysis was performed after normalizati. Data shown represent results from three independent experiments (m, P<0.01 for significant difference between compared groups.顯性突變體下調(diào) HO-1 表達(dá)一步明確 TLR6 在介導(dǎo) HO-1 表達(dá)中的作用，THP，再用 MALP-2 作用 16h。結(jié)果顯示，與對(duì)照質(zhì)粒組相（圖 1-4）。

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2802786