【摘要】：超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(extended-spectrum beta-lactamases,ESBLs)是一類能夠水解青霉素,第一代、第二代、第三代頭孢菌素及氨曲南等抗生素的一種酶,能夠被酶抑制劑所抑制,但對頭霉素、碳青霉烯類抗生素敏感。攜帶這種酶的細(xì)菌可以水解相應(yīng)的抗生素從而導(dǎo)致治療失敗。近年來,產(chǎn)ESBL微生物在世界范圍內(nèi)不斷出現(xiàn),廣泛分布于醫(yī)院臨床、社區(qū)環(huán)境以及畜牧環(huán)境中。該酶主要存在于大腸桿菌以及克雷伯氏菌,給公共健康帶來了極大的威脅。包括三種主要的類型TEM,SHV以及CTX-M,通常位于可移動(dòng)遺傳片段上。另外,菌株的克隆性傳播是ESBL基因擴(kuò)散的另一重要途徑。近年來,養(yǎng)殖環(huán)境中由于抗生素的大量使用甚至濫用,越來越多的ESBLs在養(yǎng)殖環(huán)境中出現(xiàn)。這些動(dòng)物源性的產(chǎn)ESBL的大腸桿菌會(huì)通過各種途徑向環(huán)境中擴(kuò)散,甚至通過動(dòng)物產(chǎn)品進(jìn)入食物鏈,給公共衛(wèi)生帶來了潛在的威脅。目前CTX-M是不同環(huán)境中主要的流行類型。主要發(fā)現(xiàn)于質(zhì)粒上,在不同的細(xì)菌之間,基因能夠水平轉(zhuǎn)移進(jìn)行傳遞,從而進(jìn)行耐藥的擴(kuò)散。接合轉(zhuǎn)移使其進(jìn)行散播的主要方式,通常受到環(huán)境等其他因素的影響。膨潤土是以蒙脫石為主要成分的粘土類物質(zhì),我國產(chǎn)量豐富,主要成分為SiO2和Al2O3。膨潤土由于具有吸附性好、粘附性、含礦物質(zhì)等特性,廣泛用于畜禽及水產(chǎn)動(dòng)物飼料添加劑用以吸附動(dòng)物消化道內(nèi)的有毒物質(zhì),延長飼料通過動(dòng)物消化道的速度,防止畜禽類非細(xì)菌性腹瀉。然而,膨潤土是否會(huì)對耐藥基因的轉(zhuǎn)移造成影響,引起了人們的廣泛關(guān)注。為了解目前我國的養(yǎng)豬環(huán)境中產(chǎn)ESBL大腸桿菌的流行情況及其對周圍環(huán)境的影響,以及飼料添加劑對ESBL基因在細(xì)菌之間接合轉(zhuǎn)移的影響極其機(jī)制,我們展開了以下的研究。1.養(yǎng)豬環(huán)境中豬源產(chǎn)ESBL大腸桿菌的流行情況及分子特點(diǎn)的研究為了解產(chǎn)ESBL大腸桿菌在山東地區(qū)的流行情況及其對環(huán)境的影響,我們從山東地區(qū)的10個(gè)豬場中采集豬場糞便樣品,豬場內(nèi)外的空氣樣品,水和淤泥樣品以及土壤樣品,分離產(chǎn)ESBL的大腸桿菌,并對其特點(diǎn)進(jìn)行分析。我們從六個(gè)豬場中共分離的到119株產(chǎn)ESBL的大腸桿菌他們分別來自不同的糞便樣品和環(huán)境樣品,另外四個(gè)豬場中沒有得到產(chǎn)ESBL的大腸桿菌。同一場中來源于糞便和環(huán)境樣品的產(chǎn)ESBL大腸桿菌在耐藥表型方面顯示極高的相關(guān)性,ESBL基因以CTX-M和TEM為主,同一場中不同來源的分離株ctx-m亞型種類相同,而不同場之間的分離株卻不具備這種相似性。這表明,產(chǎn)esbl大腸桿菌在該地區(qū)流行較為嚴(yán)重,且會(huì)對周圍環(huán)境造成影響。2.養(yǎng)殖場中糞便的利用引起的產(chǎn)esbl大腸桿菌對土壤的污染情況研究我們以產(chǎn)esbl大腸桿菌為指示菌,分別從糞便、堆肥及土壤中采集樣品以進(jìn)一步研究產(chǎn)esbl大腸桿菌對土壤環(huán)境的影響。共分離得到42株產(chǎn)esbl大腸桿菌,其中有29株來自于糞便樣品;分離率為72.5%,3株來自于堆肥,分離率為15%;10株來自于場外農(nóng)田中采集的土壤樣品,分離率為12.5%。來自于豬場的樣品及來自于土壤的樣品都顯示了多重耐藥,攜帶ctx-m和tem,主要為ctx-m-14和ctx-m-15亞型,復(fù)制子類型以f為主,多種復(fù)制子并存,且eric-pcr結(jié)果顯示三株土壤分離株與糞分離株的同源性高于90%,這表明他們可能來自于同一株大腸桿菌。以上結(jié)果說明了土壤中的產(chǎn)esbl大腸桿菌很可能來源于糞便。3.飼料添加劑膨潤土對耐藥基因ctx-m-15水平傳播的促進(jìn)作用研究ctx-m-15是主要的流行亞型,因此我們以攜帶ctx-m-15的f16為供體菌,它能夠?qū)︻^孢噻肟產(chǎn)生耐藥性但對卡那霉素敏感,攜帶卡那抗性的bl21(de3)為受體菌建立了體外轉(zhuǎn)移模型,研究飼料添加劑膨潤土對這種耐藥基因轉(zhuǎn)移的促進(jìn)作用。結(jié)果顯示該基因可在不同的大腸桿菌之間發(fā)生接合轉(zhuǎn)移,而飼料添加劑膨潤土能夠提高攜帶ctx-m-15的質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移頻率高達(dá)4-20倍。且接合效率受溫度及膨潤土濃度的影響。當(dāng)膨潤土的濃度為100μg/ml時(shí),這種促進(jìn)作用最明顯。4.膨潤土刺激下ctx-m-15耐藥基因水平傳播的差異蛋白質(zhì)組研究為研究飼料添加劑膨潤土對ctx-m-15基因的促轉(zhuǎn)移機(jī)制,我們采用比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究膨潤土是否存在條件下,接合菌的蛋白質(zhì)組學(xué)變化。將膨潤土培養(yǎng)條件下的混合菌提取蛋白進(jìn)行雙向電泳,尋找差異表達(dá)蛋白。將雙向電泳中的2倍以上,p值小于0.05的差異點(diǎn)用于質(zhì)譜鑒定。結(jié)果顯示有48個(gè)蛋白進(jìn)行了差異表達(dá),有29個(gè)發(fā)生差異表達(dá)的蛋白得以成功鑒定。生物信息學(xué)分析顯示這些蛋白包括25種酶及4個(gè)蛋白質(zhì),參與多種生物學(xué)過程,包括糖酵解、壓力應(yīng)激、轉(zhuǎn)運(yùn)、蛋白合成、其他物質(zhì)的合成、碳水化合物的代謝、乳糖代謝、抗生素抗性、甘油代謝、生物膜的形成及細(xì)胞趨性。在這些鑒定得到的蛋白中,主要是參與各種生物學(xué)過程的酶。這4個(gè)主要蛋白,分別為外膜通道蛋白、abc周質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、mipa互作蛋白及abc運(yùn)輸atp結(jié)合蛋白。5.膨潤土刺激下ctx-m-15水平傳播蛋白的轉(zhuǎn)錄水平及其作用研究根據(jù)Genebank上這這四個(gè)蛋白的序列,分別設(shè)計(jì)了四個(gè)基因tolC,malE,mipA及ybi T的實(shí)時(shí)熒光定量引物及全基因擴(kuò)增引物,對其進(jìn)行轉(zhuǎn)錄水平的研究。結(jié)果顯示他們在膨潤土存在條件下,供體菌,受體菌及接合菌中RNA表達(dá)量都呈明顯上升趨勢,與蛋白變化水平相一致。且在受體菌中變化幅度最大,這表明受體菌對膨潤土最為敏感。因此,我們構(gòu)建了這四個(gè)基因的表達(dá)載體,并將其轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)中,并誘導(dǎo)其表達(dá),將其作為受體菌研究這四個(gè)基因?qū)蚪Y(jié)合轉(zhuǎn)移的影響,結(jié)果顯示以這四株菌為受體菌的接合試驗(yàn)中,轉(zhuǎn)移效率皆升高。
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S852.61

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