【摘要】：豬圓環(huán)病毒(Porcine circovirus, PCV)為圓環(huán)病毒科(Circoviridae)圓環(huán)病毒屬(Circovirus)成員,包括PCV1 (Porcine circovirus type 1, PCV1)和PCV2 (Porcine circovirus type 2, PCV2)兩種血清型。PCV1是豬腎細胞系的一種污染物,對豬無致病性；PCV2是斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(Postweaning multisystemic wasting syndrome, PMWS)及其他豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾病(PCVAD)的主要病原。PCV2主要分為PCV2a和PCV2b兩個基因型,PCV2a包括2A-2E五個亞型；PCV2b包括1A、1B和1C三個亞型,其中1A、1B亞型的ORF2基因序列基本一致,進一步區(qū)分需比較ORF1序列。1C亞型的ORF2基因與1A、1B相比有較大差異,其Cap蛋白C末端出現(xiàn)一個賴氨酸(K)的延伸。PCV2已在全世界豬群蔓延,給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失。疫苗接種是預(yù)防PCV2感染的有效手段。然而疫苗免疫不能完全阻斷PCV2的感染和傳播,而且商品化的疫苗價格普遍居高,制約著PCV2疫苗的廣泛使用。因此研發(fā)安全、高效、低價的疫苗產(chǎn)品是今后研究的主要方向。本研究使用電穿孔轉(zhuǎn)染法證實Dulac細胞能顯著提高嵌合型PCV1-2b拯救效率,突破病毒增殖的瓶頸；大量制備嵌合型PCV1-2b舌病毒,動物試驗評估嵌合型PCV1-2b滅活疫苗和活疫苗的斷奶仔豬主動免疫及新生仔豬被動免疫保護效果。1. Dulac細胞拯救嵌合型PCV1-2b的轉(zhuǎn)染方法優(yōu)化本研究通過優(yōu)化脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法和電穿孔轉(zhuǎn)染法,將本室保存的pSK-dPCV1-2b重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染Dulac細胞和PK-15細胞,旨在提高嵌合型豬圓環(huán)病毒PCV1-2b的拯救效率,為疫苗生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。結(jié)果顯示,Dulac剛包轉(zhuǎn)染后的病毒滴度為PK-15細胞的100倍；Dulac細胞電轉(zhuǎn)染的優(yōu)化參數(shù)為250 V、400μs、6μg質(zhì)粒DNA、電擊3次,各因素對轉(zhuǎn)染效率的影響依次為電場強度、電擊次數(shù)、脈沖時間及質(zhì)粒DNA含量。Dulac細胞脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染優(yōu)化結(jié)果為：在質(zhì)粒DNA與轉(zhuǎn)染試劑比例為1：3時,轉(zhuǎn)染效率最高。流式細胞術(shù)檢測Dulac細胞電轉(zhuǎn)染和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的感染率,結(jié)果陽性細胞數(shù)分別占55.6%和44.2%,提示兩種方法轉(zhuǎn)染Dulac細胞的效率均較高。分別將拯救的病毒在Dulac細胞和PK-15細胞上進行連續(xù)傳代,結(jié)果病毒滴度隨著傳代數(shù)呈上升趨勢,但Dulac細胞病毒滴度(10444-105.32)顯著高于PK-15細胞(101.90-103.38)。因此,嵌合型PCV1-2b在Dulac細胞中增殖滴度更高,優(yōu)化脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法和電穿孔轉(zhuǎn)染法均能有效提高Dulac細胞的病毒拯救效率。2.嵌合型PCV1-2b滅活疫苗和活疫苗免疫保護效力比較根據(jù)PCV2 ORF1的保守序列,設(shè)計1對特異性引物和TaqMan探針,建立PCV2 TaqMan熒光定量PCR檢測方法,并評價其敏感性、特異性和重復(fù)性。結(jié)果顯示,標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率為-3.55,相關(guān)系數(shù)R2為0.999,擴增效率為96.4%,具有良好的線性關(guān)系；該方法的敏感性為5.0 copies/μL;檢測的PCV1-2、PCV1、CSFV、PRRSV、PRV、PPV基因組DNA或cDNA均無擴增曲線；8份陽性樣品的變異系數(shù)在0.98%-1.03%之間。因此,本研究建立的PCV2 TaqMan熒光定量PCR檢測方法特異性強,敏感性高,重復(fù)性良好,為嵌合型PCV1-2b疫苗免疫保護效力評估提供了科學(xué)有效方法。用抗原含量為2×105.0TCID50/mL的嵌合型PCV1-2b滅活疫苗和2×104.0TCID50/mL的嵌合型PCV1-2b活疫苗分別免疫商品豬,并以商品化PCV2b全病毒滅活疫苗作對照,評估兩種疫苗的免疫保護效力。結(jié)果顯示,免疫組試驗豬均能迅速產(chǎn)生體液免疫反應(yīng),活疫苗免疫豬血清抗體和中和抗體產(chǎn)生更早,高水平抗體維持時間更長。TaqMan熒光定量PCR檢測攻毒后血清和腹股溝淋巴結(jié)PCV2 DNA拷貝數(shù),結(jié)果攻毒對照試驗豬血清和腹股溝淋巴結(jié)檢測到大量的PCV2核酸載量,活疫苗組攻毒后21d能完全消除PCV2增殖,而滅活疫苗組有1頭豬血清樣品檢測到PCV2核酸(105.55copies/mL);滅活疫苗和活疫苗組均有2頭試驗豬腹股溝淋巴結(jié)檢測到PCV2 DNA載量(108.28、107.50 copies/g和105.93、105.57copies/g),嵌合型PCV1-2b活疫苗組低于滅活疫苗組,但差異不顯著(P0.05)。病理組織學(xué)觀察結(jié)果顯示,攻毒對照豬可見嚴重的間質(zhì)性支氣管肺炎病變,淋巴結(jié)出現(xiàn)淋巴細胞缺失和組織細胞浸潤等病理損傷,IHC檢測呈PCV2抗原陽性,而免疫組病變比攻毒對照組輕微。PCV2可通過口、鼻、糞尿等排泄物進行傳播,將病毒液接種試驗豬后發(fā)現(xiàn),攻毒對照豬鼻拭子和肛拭子樣品中PCV2核酸載量顯著高于免疫組試驗豬(P0.05)。因此,嵌合型PCV1-2b滅活疫苗和活疫苗能夠誘導(dǎo)機體產(chǎn)生有效的免疫保護,降低PCV2水平傳播的風(fēng)險,可作為防控PCV2感染的候選疫苗。3.嵌合型PCV1-2b滅活疫苗免疫母豬對所產(chǎn)仔豬免疫保護作用嵌合型PCV1-2b滅活疫苗對斷奶仔豬的免疫保護效力已經(jīng)在第二章得到證實,本研究將制備的嵌合型PCV1-2b滅活疫苗免疫妊娠母豬,對其所產(chǎn)14日齡,28日齡和42日齡仔豬進行攻毒,評價新生仔豬的被動免疫保護效力。結(jié)果顯示14日齡仔豬攻毒前母源抗體滴度最高,平均值為1：300,28日齡和42日齡仔豬血清抗體水平逐漸下降,平均值分別為1：133和1：70,至49日齡時血清中幾乎無母源抗體。14日齡仔豬僅在攻毒后]4 d有1頭豬血清中檢測到低拷貝數(shù)的病毒載量(104.90copies/mL),淋巴結(jié)觀察到輕微的淋巴細胞缺失,IHC檢測為陰性；28日齡仔豬母源抗體較低,PCV2攻毒后14 d和21 d分別有2頭豬出現(xiàn)不同程度的病毒血癥(分別為105.36copies/mL、106.39copies/mL和107.84 copies/mL、107.90 copies/mL)；42日齡仔豬攻毒后,PCV2在體內(nèi)的增殖得不到有效抑制,攻毒后7d血清中有1頭豬檢測到PCV2核酸拷貝數(shù),21 d的血清和淋巴結(jié)病毒載量接近攻毒組水平,平均值分別達10631 copies/mL和1010.77copies/g,組織病理學(xué)發(fā)現(xiàn)淋巴細胞流失嚴重并伴有巨噬細胞浸潤,IHC檢測到棕黃色陽性細胞。因此,本研究證明了嵌合型PCV1-2b滅活疫苗免疫妊娠母豬,14日齡仔豬獲得良好的保護效力,28和42日齡仔豬被動免疫保護降低：將仔豬的首免日期定在28日齡左右。4.嵌合型PCV1-2b 1B和1C亞型滅活疫苗免疫保護效力比較本研究以本室保存的pSK-sPCV1-2b 1C重組質(zhì)粒為骨架,構(gòu)建pSK-dPCV1-2b 1B感染性克隆,電穿孔轉(zhuǎn)染法拯救嵌合型PCV1-2b 1B病毒,動物試驗評價兩種嵌合型PCV1-2b滅活疫苗免疫保護效力的差異。生長動力學(xué)顯示,兩株嵌合型PCV1-2b呈現(xiàn)相似的增殖特性。試驗豬免疫后產(chǎn)生快速的體液免疫應(yīng)答,能顯著降低機體PCV2病毒載量,但免疫組之間無顯著差異(P0.05)。嵌合型PCV1-2b 1B滅活疫苗誘導(dǎo)的熒光抗體和中和抗體略高,血清病毒含量較低,在攻毒后14 d和21d能完全抑制PCV2b曾殖,腹股溝淋巴結(jié)不攜帶PCV2b核酸,IHC檢測呈陰性；嵌合型PCV1-2b 1C滅活疫苗組攻毒后21 d不能完全抑制病毒增殖,1頭豬血清中檢測到病毒載量(105.75copies/mL);腹股溝淋巴結(jié)亦有1頭豬可檢測到PCV2b核酸(108.16copies/g), IHC檢測呈弱陽性,并出現(xiàn)輕微的病理損傷。鼻拭子和肛拭子病毒含量顯示攻毒豬排毒量與血清中病毒核酸載量呈正相關(guān),免疫組PCV2b病毒核酸載量顯著低于攻毒對照組(P0.05)。因此,不同的Cap蛋白對嵌合病毒的增殖特性無明顯影響,斷奶仔豬接種嵌合型PCV1-2b 1B和1C滅活疫苗獲得的免疫保護效力無顯著差異。
【學(xué)位授予單位】：揚州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S852.651
【圖文】：

２形態(tài)學(xué)及生物學(xué)特征逡逑ＰＣＶ２是至今發(fā)現(xiàn)最小的動物病毒，在電鏡下觀察為直徑約１７－２２ｎｍ，呈球形、邊緣逡逑較清晰無裹膜的病毒粒子，見圖１。由于病毒由衣殼蛋白和單鏈ＤＮＡ組成，ＰＣＶ２對酒精、逡逑氯仿、艦和苯酷等脂溶性消毒劑具有較強的抵抗力，但易被堿性消毒劑、氧化物、四價氨逡逑化合物滅活ｔＷ。病毒不具有血凝性，７０’Ｃ邋１５邋ｍｉｎ和ｐＨ邋３．０的酸性環(huán)境仍保持感染性［１２１。逡逑病毒粒子在ＣｓＣｌ中的浮為密度為１．３６邋ｇ／ｍＬ１．３７邋ｇ／ｍＬ，沉降系數(shù)為５７邋Ｓ。ＰＣＶ２可感染不逡逑同來源的動物細胞ｆｉｗｙ，但只在豬源和Ｖｅｒｏ細胞系中增殖，不產(chǎn)生ＣＰＥ。逡逑

即邋ＯＲＨ－ＯＲＦｌｌ，ＰＣＶｌ邋與邋ＰＣＶ２邋的邋ＯＲＦｌ、２、３、４、７、８邋具有一定同源性，其余逡逑ＯＲＦｓ無同源化見表１＾氣其中，ＯＲＦ１、５、７和１０位于病毒基因姐的正鏈上；ＯＲＦ２、逡逑３、４、６、８、９和１１位于病毒基因組的互補鏈上，見圖２ＰＳ１。ＯＲＦ１和ＯＲＦ２為ＰＣＶ２最逡逑大的兩個ＯＲＦｓ，編碼的Ｒｅｐ蛋白和Ｃ巧蛋白使病毒基因組能夠復(fù)制并組裝成成熟的子代逡逑病毒。逡逑

Ｒｅｐ和Ｃａｐ基因之間，該區(qū)域包含圓環(huán)病毒屬復(fù)制特有的莖環(huán)結(jié)構(gòu)（ｓｔｅｍ－ｌｏｏｐ）及頂部保逡逑守的九聚體序列（ＡＸＴＡＸＴＡＣＣ），在其兩側(cè)有一段１１個核昔酸的重復(fù)序列（回文區(qū)域）。逡逑鄰近回文區(qū)域有六聚體和五聚體的重復(fù)，見圖３。Ｒｅｐ和Ｒｅｐ＇蛋白的結(jié)合位點為３＇－端的反逡逑向重復(fù)和六聚體Ｈ１和Ｈ２，邋Ｒｅｐ和Ｒｅｐ＇蛋白結(jié)合使ｄｓＤＮＡ解鏈，然后暴露的ｓｓＤＮＡ形成逡逑九聚體序列，Ｒｅｐ和Ｒｅｐ＇蛋白識別切開起始病毒的復(fù)制Ｃｈｅｕｎｇ等（２００３）研究證明，逡逑ＰＣＶ在感染細胞后，ＯＲＦ１轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生８種ＲＮＡｓ，其中民巧、Ｒｅｐ＇、民ｅｐ３ａ、Ｒ巧化、Ｒｅｐ３ｃ逡逑可（＾１通過Ｎｏｒｔｈｅｒｎ雜交檢測到，ＮＳ５１５、Ｗ６７２和ＮＳ０含量較低，只能通過ＰＣＲ方法檢逡逑測到１４５１。運用點突變方法證明，民巧和Ｒｅｐ＇蛋白是病毒復(fù)制必須的原件，但其他較小的ＲＮＡｓ逡逑是否編碼蛋白Ｗ及它們在病毒生命周期的作用尚未明確１４６’４７１。逡逑－逡逑Ｉ＂＊邋Ｖ邐＇７１邋？逡逑＼邋ｊｔ邐Ｏｒｉｇｉｎ邋ｏｆ邋ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ逡逑＜＊■邋Ｉ邐ＪｌＯＧＡＣ逡逑…邋說邐Ｈ３邐餅．逡逑盧ｓ逡逑０ＲＦ２邋ｅｎｃｏｄｅｓ邋樂邐％邋ａ一逡逑Ｃａｐ邋ｐｆｏｌｅｉｎ邋ｍ邐NB。。逡逑§邐■邋ｅｎｃｏｄｅｓ邋Ｒｅｐ邋ａｎｄ邋Ｒｅｐ邋ｐｒｏｔｅｉｎｓ逡逑畫邐Ｇｅｎｏｍｅ邋Ｏｆ邋悘逡逑圖３邋ＰＣＶ莖環(huán)結(jié)構(gòu)和六聚體重復(fù)序列（引自ＩＷ）逡逑Ｆｉｇ．邋３．邋Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｇｅｎｏｍｅ邋ｏｆ邋ＰＣＶ２逡逑５．２邋ＯＲＦ２逡逑ＯＲＦ２基因位于病毒核酸的負鏈上

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本文編號：2793209