【摘要】：缺鐵黃葉病對果樹的產(chǎn)量、品質(zhì)、樹勢及經(jīng)濟(jì)效益均造成極大的損失,因此尋求矯治缺鐵失綠癥的各種途徑和方法變得越來越重要。小金海棠是鐵高效基因型,可以用作一個砧木幫助蘋果在鐵缺乏的條件下正常生長和發(fā)育。小金海棠在應(yīng)答缺鐵脅迫時會加強(qiáng)根部鐵吸收,然而其鐵高效機(jī)理還不是很清楚。本文以小金海棠(Malus xiaojinensis)為試驗(yàn)材料,克隆了小金海棠鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因MxNRAMP1,并通過其基因特征以及功能分析,來探究MxNRAMP1基因參與小金海棠鐵吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)的方式與作用。主要結(jié)果如下： 1、MxNRAMP1基因全長1656bp,共編碼551個氨基酸,預(yù)測其編碼的蛋白質(zhì)分子量為59.80kD,等電點(diǎn)為8.05。多序列比對表明,MxNrampl與其他物種的Nramp均有不同程度的同源性。MxNRAMP1蛋白分析表明其包含了10個跨膜結(jié)構(gòu)域,具有葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽,可能定位于葉綠體,無分泌通路信號肽。 2、檢測了不同鐵處理的MxNRAMP1轉(zhuǎn)錄表達(dá)譜,MxNRAMP1在根和葉中的表達(dá)均受缺鐵誘導(dǎo),而且在根中的表達(dá)量明顯高于葉片。與對照(正常鐵處理)相比,在缺鐵處理3d,6d,9d的根中,MxNRAMP1轉(zhuǎn)錄提高4倍以上；相對于根,新葉和老葉中的MxNRAMP1的誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)比較遲,在缺鐵9d才顯示了較為明顯的上調(diào)。缺鐵處理下施加生長素抑制劑NPA會抑制缺鐵脅迫對MxNRAMP1的誘導(dǎo)。 3、穩(wěn)定轉(zhuǎn)基因煙草植株表現(xiàn)出比野生型和轉(zhuǎn)空載植株更為耐缺鐵,各種鐵處理下,轉(zhuǎn)基因株系的新葉與根中Fe、Mn濃度高于轉(zhuǎn)空載株系與野生型,Zn濃度沒有明顯差異。結(jié)果表明：MxNRAMPl過表達(dá)促進(jìn)轉(zhuǎn)基因煙草根對鐵的吸收及鐵在根和葉中的積累,從而導(dǎo)致對鐵脅迫的抗性增強(qiáng)；過表達(dá)轉(zhuǎn)基因煙草中的蛋白表達(dá)分析表明,根中MxNRAMP1蛋白的表達(dá)受到缺鐵誘導(dǎo)。 4、洋蔥表皮亞細(xì)胞定位分析表明MxNRAMP1蛋白主要定位在細(xì)胞膜上,利用玉米原生質(zhì)瞬時表達(dá)體系和轉(zhuǎn)基因煙草免疫電鏡定位技術(shù)進(jìn)一步證明,MxNRAMP1主要存在于細(xì)胞質(zhì)膜與膜泡上,顯示MxNRAMP1蛋白為明顯的功能性基因蛋白。有趣的是,缺鐵脅迫可誘導(dǎo)MxNRAMP1蛋白以膜泡內(nèi)吞方式,轉(zhuǎn)運(yùn)鐵離子到達(dá)特定的細(xì)胞器(溶酶體、葉綠體)。 上述結(jié)果表明,在小金海棠中,MxNRAMP1不僅在鐵吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)中起著重要作用,而且還可以通過MxNRAMP1內(nèi)吞使植物產(chǎn)生缺鐵適應(yīng)反應(yīng)。
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：Q943.2
【圖文】：

MK ..二: ‘ ? .■?:_?? ■■■-圖3-4M}(;NRAMPl保守結(jié)構(gòu)域分析Fig.3-4 Analysis conserved domain of MxNRAMPISanalP-4 1 predsction (euk networks}' MRAMF1I ‘”"? ' ‘ ‘ C-score -?10 ■ Sscore .Y-scoreo.a - ■0.6 - I ■I 。.4 . j |j I ; . ?。之 I ‘ !jH,lpA k .：■0,0 .二一 rt- —■ *Ji '殊 ji-ar?? * i 二 -, I > t t... I..,.,.. - —.t—- 0 100 200 300 400 500 $00Position圖3-5 MxNRAMPI編碼蛋白的信號肽序列預(yù)測分析Figure 3-5 The prediction of signal peptide of MxNRAMPI32 MxNRAMPI基因的表達(dá)分析3.2.1缺鐵處理MxNRAMPI基因的表達(dá)為了進(jìn)一步研究MxNRAMPI基因與鐵脅迫之間的關(guān)系，檢測了不同鐵處理的MxNRAMPI轉(zhuǎn)錄表達(dá)譜。結(jié)果表明：MxNRAMPI在根中的農(nóng)達(dá)量明顯高于葉片，而且根和葉中的表達(dá)均受缺鐵脅迫誘導(dǎo)（圖3-6)。與對照相比，在缺鐵處理3d, 6d, 9d的根中，MxNRAMPI轉(zhuǎn)錄提高4倍以上；相對于根，新葉和老葉中的MxMMMW的誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)比較遲，在缺鐵9 d才顯示了較為明顯的上調(diào)(圖3-6 B, C)。25

圖3-7-NAA/NPA處理下小金海棠根中A/xTV兄^A//V表達(dá)情況+Fe為正常供鐵處理；-Fe為低鐵處理；+NAA為施加NAA; +NPA為施加NPAFigure 3-7 Expression of NRAMPl in root of M xiaojinensis after NAA/NPA treatment+Fe means normal condition ； -Fe means low iron stress ；+NAA means add NAA； +NPA means add NPA

圖3-11 MxNRAMPl蛋白在洋蔥表皮中亞細(xì)胞定位分析A, B, C：轉(zhuǎn)有pEZS-MxNRAVIPI的洋蔥表皮細(xì)胞綠色‘艾光分布情況；D, E, F：轉(zhuǎn)化對照質(zhì)粒的洋蔥表皮細(xì)胞的綠色W光分布憒況。Figure 3-11 Subcellular localization of the MxNRAMPl protein in onion epidermal cells

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2762574