【摘要】：犬瘟熱病毒(Canine distemper virus, CD V)屬于副粘病毒科麻疹病毒屬,病毒粒子有囊膜,基因組為單股負鏈RNA,大小為15690nt。自基因組的3’端至5’端,依次為3’引導序列、結(jié)構(gòu)蛋白(N、P、M、F、H、L)基因、5’尾隨序列。CDV可感染肉食目大多數(shù)動物而致病,免疫接種是目前唯一有效防治該病的措施。 不分節(jié)段單股負鏈RNA病毒(Nonsegmented negative-strand RNA viruses, NNSVs)由于其只在細胞質(zhì)復制,避免與宿主基因組發(fā)生整合,安全性高；病毒各蛋白的模塊式表達方式,方便外源基因的表達；病毒基因組包裝容量大,可插入長達4-5kb的外源基因；外源基因于重組病毒中能穩(wěn)定、高效的得到表達等諸多優(yōu)點,常用作重組疫苗載體的研究。CDV作為NNSVs的一員,有極大的作為活病毒疫苗載體的潛力。本課題擬建立弱毒株CDV-L反向遺傳學操作平臺,并探究其用作活病毒疫苗載體的潛力。 對本實驗室保存的弱毒株CDV-L進行序列測定,在此基礎之上,分6段對CDV-L全長進行擴增,最后利用In-Fusion無縫連接技術(shù)構(gòu)建病毒基因組全長cDNA克隆載體,并于基因組3’端引入T7RNA聚合酶啟動子,5’端引入丁肝核酶序列。構(gòu)建核衣殼蛋白N、P、L基因的輔助表達載體。建立了一株穩(wěn)定表達T7RNA聚合酶的細胞系BHK-T7,將上述各質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染該細胞系成功拯救了rCDV-L。 將EGFP基因插入CDV-L基因組P、M之間的非編碼區(qū),拯救成功的重組病毒感染細胞內(nèi)有綠色熒光蛋白的產(chǎn)生,證明rCDV-L可作為載體表達外源蛋白。 進一步,分別將狂犬病毒(Rabies virus, RV) Flury-LEP株G蛋白和水貂腸炎細小病毒(Mink enteritis virus, MEV) VP2蛋白基因插入病毒基因組,拯救重組病毒rCDV-RV-G和rCDV-MEV-VP2并探究rCDV-L作為活病毒疫苗載體的能力。實驗結(jié)果證實,rCDV-RV-G感染細胞內(nèi)G蛋白得以表達,且插入到重組病毒粒子的囊膜中。rCDV-RV-G免疫小鼠和狗,二者體內(nèi)均能產(chǎn)生抗CDV和RV的中和抗體,證明rCDV-RV-G具有雙價疫苗的潛質(zhì),rCDV-L具有活病毒疫苗載體的能力。重組病毒rCDV-MEV-VP2, VP2基因的插入雖然不影響病毒的拯救,但病毒感染的細胞內(nèi)檢測不到VP2的表達。將VP2-N端一段具有抗原表位的小肽段基因與G蛋白基因進行無縫連接,重組病毒rCDV-G-VN感染細胞內(nèi)雖然有外源蛋白的表達,但將重組病毒rCDV-G-VN免疫小鼠,免疫小鼠血清中未能檢測到MEV的中和抗體。具體原因有待進一步研究。 本課題成功構(gòu)建了CDV-L反向遺傳學操作平臺,并證實CDV-L具有一定的活病毒疫苗載體的潛質(zhì)。
【學位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S852.65
【圖文】：

I圖1-1犬瘟熱病毒基因組結(jié)構(gòu)示意田（Fields Virology, 5th Edition)Figure 1-1 Genetic map of canine distemper virus (Fields Virology, 5th Edition)P glycoprotein spike柳 glycopro^丨n spike“pid bilaymM proteinRNA + N + P . L圖1-2犬疲熱病毒結(jié)構(gòu)示意圖（Fie丨ds Virology，5th Edition)Figure 1-2 Schematic diagram of canine distemper virus (Fields Virology, 5th Edition)1.2.1 核蛋白（Nucleocapsid protein，N)CDV的N蛋內(nèi)基因長度為1683 nt,僅有一個開放閱讀框（Open reading frame，ORF)，起始丁第108-110位的AUG,終止丁?第1677-1679位的UAA，共編碼523個氨基酸，分子量約為58 kDa。在CDV的結(jié)構(gòu)蛋內(nèi)中，N蛋Qg是第一個被翻譯出來的

由細胞膜衍生而來，膜農(nóng)而含病毒糖蛋l(fā)U H、F, 二者形成1.3 nm纖突。囊膜內(nèi)部含有非糖基化基質(zhì)蛋l(fā)U M (圖1-2)。M WWC M r MM I圖1-1犬瘟熱病毒基因組結(jié)構(gòu)示意田（Fields Virology, 5th Edition)Figure 1-1 Genetic map of canine distemper virus (Fields Virology, 5th Edition)P glycoprotein spike柳 glycopro^丨n spike“pid bilaymM proteinRNA + N + P . L圖1-2犬疲熱病毒結(jié)構(gòu)示意圖（Fie丨ds Virology，5th Edition)Figure 1-2 Schematic diagram of canine distemper virus (Fields Virology, 5th Edition)1.2.1 核蛋白（Nucleocapsid protein，N)CDV的N蛋內(nèi)基因長度為1683 nt,僅有一個開放閱讀框（Open reading frame，ORF)，起始丁第108-110位的AUG,終止丁?第1677-1679位的UAA，共編碼523個氨基酸，分子量約為58 kDa。在CDV的結(jié)構(gòu)蛋內(nèi)中，N蛋Qg是第一個被翻譯出來的

中B農(nóng)業(yè)人學博士學位論文 第一章文獻綜述QIMW組成，位丁?信號肽C端(von Messling and Cattaneo, 2002)。F蛋內(nèi)通常是以三聚體的形式存在，多聚化過程發(fā)生在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中(Plemperet al.，200])。隨后，F(xiàn)0 二聚體蛋內(nèi)由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)運向高爾基體，并丁?高爾基體中完成各種修飾，最重耍的就是由弗林蛋內(nèi)_切割F0蛋內(nèi)上特異位點RRQRRi ,形成由二硫鍵共價連接的n、F2亞單位(Bolt and Pedersen, 1998)。FO的切割是F蛋內(nèi)A?備活性的必然過程。切割形成的F1由二部分紐成：N端強疏水性的融合肽、C端疏水性穿膜區(qū)以及C末端由33個氨基酸組成的胞內(nèi)區(qū)_。新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)中F蛋內(nèi)結(jié)晶體的獲得為F蛋ft空間結(jié)構(gòu)的研究提供了直接證據(jù)，如圖1-4所示，F(xiàn)蛋A單體相互纏繞形成二聚體，從側(cè)面看分為頭、頸、桿三部分，頭部和頸部由F】、F2共同組成，桿部比較L<:，由122-171位氨基酸無規(guī)卷曲相互纏繞形成(Morrison, 2003)。

【共引文獻】

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本文編號：2752317