【摘要】：犬瘟熱病毒(Canine distemper virus, CD V)屬于副粘病毒科麻疹病毒屬,病毒粒子有囊膜,基因組為單股負(fù)鏈RNA,大小為15690nt。自基因組的3’端至5’端,依次為3’引導(dǎo)序列、結(jié)構(gòu)蛋白(N、P、M、F、H、L)基因、5’尾隨序列。CDV可感染肉食目大多數(shù)動物而致病,免疫接種是目前唯一有效防治該病的措施。 不分節(jié)段單股負(fù)鏈RNA病毒(Nonsegmented negative-strand RNA viruses, NNSVs)由于其只在細(xì)胞質(zhì)復(fù)制,避免與宿主基因組發(fā)生整合,安全性高；病毒各蛋白的模塊式表達(dá)方式,方便外源基因的表達(dá)；病毒基因組包裝容量大,可插入長達(dá)4-5kb的外源基因；外源基因于重組病毒中能穩(wěn)定、高效的得到表達(dá)等諸多優(yōu)點(diǎn),常用作重組疫苗載體的研究。CDV作為NNSVs的一員,有極大的作為活病毒疫苗載體的潛力。本課題擬建立弱毒株CDV-L反向遺傳學(xué)操作平臺,并探究其用作活病毒疫苗載體的潛力。 對本實(shí)驗(yàn)室保存的弱毒株CDV-L進(jìn)行序列測定,在此基礎(chǔ)之上,分6段對CDV-L全長進(jìn)行擴(kuò)增,最后利用In-Fusion無縫連接技術(shù)構(gòu)建病毒基因組全長cDNA克隆載體,并于基因組3’端引入T7RNA聚合酶啟動子,5’端引入丁肝核酶序列。構(gòu)建核衣殼蛋白N、P、L基因的輔助表達(dá)載體。建立了一株穩(wěn)定表達(dá)T7RNA聚合酶的細(xì)胞系BHK-T7,將上述各質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染該細(xì)胞系成功拯救了rCDV-L。 將EGFP基因插入CDV-L基因組P、M之間的非編碼區(qū),拯救成功的重組病毒感染細(xì)胞內(nèi)有綠色熒光蛋白的產(chǎn)生,證明rCDV-L可作為載體表達(dá)外源蛋白。 進(jìn)一步,分別將狂犬病毒(Rabies virus, RV) Flury-LEP株G蛋白和水貂腸炎細(xì)小病毒(Mink enteritis virus, MEV) VP2蛋白基因插入病毒基因組,拯救重組病毒rCDV-RV-G和rCDV-MEV-VP2并探究rCDV-L作為活病毒疫苗載體的能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí),rCDV-RV-G感染細(xì)胞內(nèi)G蛋白得以表達(dá),且插入到重組病毒粒子的囊膜中。rCDV-RV-G免疫小鼠和狗,二者體內(nèi)均能產(chǎn)生抗CDV和RV的中和抗體,證明rCDV-RV-G具有雙價疫苗的潛質(zhì),rCDV-L具有活病毒疫苗載體的能力。重組病毒rCDV-MEV-VP2, VP2基因的插入雖然不影響病毒的拯救,但病毒感染的細(xì)胞內(nèi)檢測不到VP2的表達(dá)。將VP2-N端一段具有抗原表位的小肽段基因與G蛋白基因進(jìn)行無縫連接,重組病毒rCDV-G-VN感染細(xì)胞內(nèi)雖然有外源蛋白的表達(dá),但將重組病毒rCDV-G-VN免疫小鼠,免疫小鼠血清中未能檢測到MEV的中和抗體。具體原因有待進(jìn)一步研究。 本課題成功構(gòu)建了CDV-L反向遺傳學(xué)操作平臺,并證實(shí)CDV-L具有一定的活病毒疫苗載體的潛質(zhì)。
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S852.65
【圖文】：

I圖1-1犬瘟熱病毒基因組結(jié)構(gòu)示意田（Fields Virology, 5th Edition)Figure 1-1 Genetic map of canine distemper virus (Fields Virology, 5th Edition)P glycoprotein spike柳 glycopro^丨n spike“pid bilaymM proteinRNA + N + P . L圖1-2犬疲熱病毒結(jié)構(gòu)示意圖（Fie丨ds Virology，5th Edition)Figure 1-2 Schematic diagram of canine distemper virus (Fields Virology, 5th Edition)1.2.1 核蛋白（Nucleocapsid protein，N)CDV的N蛋內(nèi)基因長度為1683 nt,僅有一個開放閱讀框（Open reading frame，ORF)，起始丁第108-110位的AUG,終止丁?第1677-1679位的UAA，共編碼523個氨基酸，分子量約為58 kDa。在CDV的結(jié)構(gòu)蛋內(nèi)中，N蛋Qg是第一個被翻譯出來的

由細(xì)胞膜衍生而來，膜農(nóng)而含病毒糖蛋l(fā)U H、F, 二者形成1.3 nm纖突。囊膜內(nèi)部含有非糖基化基質(zhì)蛋l(fā)U M (圖1-2)。M WWC M r MM I圖1-1犬瘟熱病毒基因組結(jié)構(gòu)示意田（Fields Virology, 5th Edition)Figure 1-1 Genetic map of canine distemper virus (Fields Virology, 5th Edition)P glycoprotein spike柳 glycopro^丨n spike“pid bilaymM proteinRNA + N + P . L圖1-2犬疲熱病毒結(jié)構(gòu)示意圖（Fie丨ds Virology，5th Edition)Figure 1-2 Schematic diagram of canine distemper virus (Fields Virology, 5th Edition)1.2.1 核蛋白（Nucleocapsid protein，N)CDV的N蛋內(nèi)基因長度為1683 nt,僅有一個開放閱讀框（Open reading frame，ORF)，起始丁第108-110位的AUG,終止丁?第1677-1679位的UAA，共編碼523個氨基酸，分子量約為58 kDa。在CDV的結(jié)構(gòu)蛋內(nèi)中，N蛋Qg是第一個被翻譯出來的

中B農(nóng)業(yè)人學(xué)博士學(xué)位論文 第一章文獻(xiàn)綜述QIMW組成，位丁?信號肽C端(von Messling and Cattaneo, 2002)。F蛋內(nèi)通常是以三聚體的形式存在，多聚化過程發(fā)生在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中(Plemperet al.，200])。隨后，F(xiàn)0 二聚體蛋內(nèi)由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)運(yùn)向高爾基體，并丁?高爾基體中完成各種修飾，最重耍的就是由弗林蛋內(nèi)_切割F0蛋內(nèi)上特異位點(diǎn)RRQRRi ,形成由二硫鍵共價連接的n、F2亞單位(Bolt and Pedersen, 1998)。FO的切割是F蛋內(nèi)A?備活性的必然過程。切割形成的F1由二部分紐成：N端強(qiáng)疏水性的融合肽、C端疏水性穿膜區(qū)以及C末端由33個氨基酸組成的胞內(nèi)區(qū)_。新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)中F蛋內(nèi)結(jié)晶體的獲得為F蛋ft空間結(jié)構(gòu)的研究提供了直接證據(jù)，如圖1-4所示，F(xiàn)蛋A單體相互纏繞形成二聚體，從側(cè)面看分為頭、頸、桿三部分，頭部和頸部由F】、F2共同組成，桿部比較L<:，由122-171位氨基酸無規(guī)卷曲相互纏繞形成(Morrison, 2003)。

【共引文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 朱既明,田淑芳,任貴方;關(guān)于《甲型流行性感冒病毒自然溫度敏感(ts)株的發(fā)現(xiàn)及其意義》的幾點(diǎn)討論[J];病毒學(xué)報(bào);1989年03期

2 殷相平;李志勇;李江濤;李寶玉;蘭喜;楊彬;李學(xué)瑞;柳紀(jì)省;;表達(dá)狂犬病毒糖蛋白和核蛋白的重組腺病毒的生物學(xué)特性及免疫研究[J];甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào);2009年04期

3 趙文年;王清華;劉春菊;王淑娟;雷程紅;包靜月;王志亮;;小反芻獸疫病毒Tibet 07株F蛋白在昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)及其抗原性鑒定[J];中國畜牧獸醫(yī);2014年08期

4 鄭韶結(jié);施赫赫;;狂犬病病毒磷蛋白的相關(guān)研究概況[J];廣東畜牧獸醫(yī)科技;2014年03期

5 蘇春霞;段相國;曹瑞兵;鄭潔;黃菱;郭琳;陳溥言;;重組豬IL-2對口蹄疫重組腺病毒免疫增強(qiáng)效果的研究[J];免疫學(xué)雜志;2014年02期

6 Kathryn Edenborough;Glenn A Marsh;;Reverse genetics: Unlocking the secrets of negative sense RNA viral pathogens[J];World Journal of Clinical Infectious Diseases;2014年04期

7 齊燕妮;廖玉才;胡祖權(quán);章美云;李和平;;人類免疫缺陷病毒單克隆抗體在小麥胚乳中的表達(dá)[J];華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào);2013年01期

8 嚴(yán)玉蘭;賈麗娟;劉洋;張金;張杰;梁冰;步雪峰;;重組新城疫病毒rl-RVG抑制A549荷瘤鼠的瘤體生長[J];基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床;2014年11期

9 李文桂;陳雅棠;;病毒轉(zhuǎn)基因番茄疫苗研制現(xiàn)狀[J];熱帶醫(yī)學(xué)雜志;2011年11期

10 戴海燕;王華;文少敏;解娜;;牙齦卟啉單胞菌菌毛融合抗原基因果實(shí)特異表達(dá)載體的構(gòu)建及意義[J];山東醫(yī)藥;2011年31期

相關(guān)會議論文 前2條

1 歐陽俊;余杰;;犬瘟熱診斷和防制研究進(jìn)展[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會養(yǎng)犬學(xué)分會第十二次全國養(yǎng)犬學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2007年

2 殷相平;易詠竹;李志勇;李江濤;張韻;張志芳;柳紀(jì)省;;狂犬病毒核蛋白在家蠶桿狀病毒中的高效表達(dá)及其在小白鼠的免疫研究[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會生物制品學(xué)分會中國微生物學(xué)會獸醫(yī)微生物學(xué)專業(yè)委員會2010年學(xué)術(shù)年會（第三屆中國獸藥大會學(xué)術(shù)論壇）論文集[C];2010年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 殷相平;動物狂犬病基因工程亞單位疫苗研究[D];甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué);2011年

2 潘耀謙;犬瘟熱發(fā)病機(jī)理的免疫及分子病理學(xué)研究[D];中國農(nóng)業(yè)大學(xué);2005年

3 任琦;人參愈傷組織細(xì)胞表達(dá)CTB-hIFN-α2b融合蛋白的研究[D];吉林大學(xué);2009年

4 李天松;不同宿主來源犬瘟熱病毒遺傳分析與生物學(xué)特性研究[D];吉林農(nóng)業(yè)大學(xué);2012年

5 焦文強(qiáng);兩株狂犬病病毒全基因組序列測定及aG株反向遺傳操作系統(tǒng)的建立[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2013年

6 王秋霞;小反芻獸疫病毒樣顆粒的裝配與釋放研究[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2013年

7 張新濤;新城疫病毒NDV4-C株反向遺傳操作系統(tǒng)的建立及耐熱應(yīng)用研究[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2013年

8 胡增壘;基因Ⅶd亞型新城疫病毒嚴(yán)重侵害免疫系統(tǒng)的分子基礎(chǔ)和宿主機(jī)制[D];揚(yáng)州大學(xué);2013年

9 劉拂曉;小反芻獸疫病毒樣顆粒的構(gòu)建及對小鼠免疫效力的評價[D];吉林大學(xué);2013年

10 趙偉;新城疫病毒VG/GA毒株反向遺傳系統(tǒng)的建立及最佳外源基因表達(dá)位置的確定[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2013年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 劉波波;犬瘟熱病毒的分離、鑒定及單克隆抗體的研制[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2011年

2 楊應(yīng)麗;犬瘟熱病毒Lederle株H、N基因的克隆、序列分析及表達(dá)[D];首都師范大學(xué);2007年

3 司微;鑒別犬瘟熱病毒強(qiáng)毒株和弱毒株的復(fù)合RT-nPCR方法的建立及初步應(yīng)用[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2007年

4 時紅星;犬瘟熱病毒的分離及單克隆抗體的研制[D];揚(yáng)州大學(xué);2008年

5 梁哲;禽流感血凝素融合基因表達(dá)載體的構(gòu)建及其在煙草和百脈根中的表達(dá)[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2008年

6 李田;乙肝病毒表面抗原基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建及其在煙草和番茄中的表達(dá)[D];福建師范大學(xué);2008年

7 趙化陽;獸醫(yī)微生物資源標(biāo)準(zhǔn)化平臺中PRRSV和CDV的分離鑒定及保存[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2008年

8 曹蕾;狂犬病毒N基因的真核表達(dá)及鑒定[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2009年

9 尹偉;基于桿狀病毒表達(dá)的犬狂病病毒NP蛋白的ELISA抗體檢測方法建立[D];浙江大學(xué);2009年

10 姜三杰;轉(zhuǎn)禽流感血凝素基因百脈根植株的獲得及篩選[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2010年

本文編號：2752317