【摘要】：mi R-1188位于小鼠12號(hào)染色體(12q F1)Dlk1-Dio3印記簇內(nèi),其宿主基因Meg8是一個(gè)母本表達(dá)的長(zhǎng)非編碼RNA。在Dlk1-Dio3印記區(qū)內(nèi)存在著哺乳動(dòng)物中最大的mi RNAs簇,其區(qū)域內(nèi)的元件Meg3(Gtl2)、anti-sense Rtl1(as-Rtl1)、Meg8(Rian)內(nèi)含子中以及基因間都有mi RNAs的存在。其中,小鼠內(nèi)mi RNAs總數(shù)量52個(gè),人為54個(gè),它們中的大多數(shù)mi RNAs是同源的,且只有mi R-1247為反向轉(zhuǎn)錄。已有研究表明,Dlk1-Dio3區(qū)域內(nèi)的元件以及mi RNAs對(duì)胚胎發(fā)育和癌癥發(fā)生中都有重要的作用。其中,Meg3的缺失會(huì)阻止胚胎發(fā)育以及肝癌的發(fā)生;而分別位于位于mi R-1188上下游的mi R-127和mi R-370,均影響胚胎發(fā)育并誘發(fā)肝癌的發(fā)生,這暗示著mi R-1188的表達(dá)變化可能與簇內(nèi)其它基因具有相同的生物學(xué)功能。故本文以小鼠Dlk1-Dio3區(qū)域內(nèi)的mi R-1188為研究對(duì)象,分析了胚胎發(fā)育過(guò)程中的動(dòng)態(tài)變化,并結(jié)合發(fā)育相關(guān)靶基因?qū)i R-1188在胚胎發(fā)育過(guò)程中的功能進(jìn)行分析;同時(shí)以mi R-1188特異性低表達(dá)的肝癌細(xì)胞Hepa1-6為研究對(duì)象,結(jié)合腫瘤相關(guān)靶基因解析mi R-1188在肝癌細(xì)胞中的作用。本研究首先分析了mi R-1188在胚胎發(fā)育的各個(gè)時(shí)期以及不同鼠源癌癥細(xì)胞系內(nèi)的表達(dá)情況。定量結(jié)果表明mi R-1188成熟體廣泛表達(dá)于胚胎發(fā)育的各個(gè)時(shí)期,在早期胚胎發(fā)育的4-細(xì)胞內(nèi)表達(dá)較高,至發(fā)育中后期E12.5到E18.5天表達(dá)逐漸升高;而且在E15.5天的肝臟中特異性高表達(dá),腦、肺臟和心臟次之,腎臟中表達(dá)相對(duì)較低,原位雜交結(jié)果表明mi R-1188在E15.5的表達(dá)模式與宿主基因Meg8的表達(dá)模式是相一致的;伴隨肝臟發(fā)育功能的轉(zhuǎn)移,其表達(dá)水平逐漸下調(diào),即mi R-1188在胚肝造血期高表達(dá),其中E15.5天達(dá)到最高,出生后表達(dá)降低;而后對(duì)鼠源的各種癌癥細(xì)胞系內(nèi)mi R-1188表達(dá)分析發(fā)現(xiàn),在肝癌細(xì)胞Hepa1-6內(nèi)的表達(dá)量相對(duì)最低,同時(shí)證實(shí)mi R-1188在正常成體肝臟組織和Hepa1-6細(xì)胞內(nèi)差異表達(dá),該結(jié)果意味著mi R-1188與癌癥發(fā)生存在相關(guān)性。為一進(jìn)步了解mi R-1188對(duì)胚胎發(fā)育的影響,通過(guò)尾靜脈注射過(guò)表達(dá)mi R-1188的慢病毒載體至妊娠初期孕鼠,過(guò)表達(dá)mi R-1188后引起E15.5天胚胎體重減輕,相應(yīng)胎盤重量增加;定量結(jié)果表明mi R-1188成熟體在全胚、胎盤以及羊膜上均有過(guò)量富集;其中,在E15.5天肺臟和肝臟內(nèi)都呈現(xiàn)出高表達(dá);但HE及原位雜交數(shù)據(jù)表明過(guò)表達(dá)mi R-1188后并未引起胚胎內(nèi)各主要臟器細(xì)胞的異常;由于mi RNAs是通過(guò)調(diào)控靶基因而發(fā)揮功能,本研究通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè),并結(jié)合雙熒光素酶報(bào)告基因和Western blot,證實(shí)胚胎發(fā)育相關(guān)基因Smad3為mi R-1188的靶基因之一;相關(guān)性分析證實(shí),二者在小鼠胚胎發(fā)育各個(gè)時(shí)期的表達(dá)存在負(fù)相關(guān),即Smad3在小鼠胚胎早期發(fā)育中的2-細(xì)胞期相對(duì)4-細(xì)胞高表達(dá),發(fā)育中期E15.5天低表達(dá),以及E15.5天內(nèi)肝臟的特異性低表達(dá)等;而且,在過(guò)表達(dá)mi R-1188的胚胎內(nèi)檢測(cè)其Smad3的表達(dá),發(fā)現(xiàn)Smad3在胎盤、心臟、肝臟和腎臟中同樣存在負(fù)相關(guān),該結(jié)果表明mi R-1188通過(guò)調(diào)控發(fā)育功能基因Smad3的表達(dá),參與胚胎發(fā)育。最后,為確定mi R-1188在癌癥中的重要功能,本研究通過(guò)改變內(nèi)源性mi R-1188的表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)mi R-1188可抑制肝癌細(xì)胞Hepa1-6的增殖、侵襲和遷移,引起細(xì)胞鋪展面積的減小,同時(shí)促進(jìn)細(xì)胞凋亡和Caspase-3的激活;而且,mi R-1188直接靶向腫瘤相關(guān)基因Bcl-2和Sp1,且在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控二者的表達(dá),同時(shí)發(fā)現(xiàn)mi R-1188與Bcl-2和Sp1在正常肝臟組織和肝癌細(xì)胞Hepa1-6內(nèi)表達(dá)水平存在負(fù)相關(guān);過(guò)表達(dá)mi R-1188后上調(diào)相關(guān)凋亡基因Bax和p53的表達(dá),以及下調(diào)Bcl-XL的表達(dá);進(jìn)一步分析證明,Hepa1-6細(xì)胞內(nèi)分別共轉(zhuǎn)染mi R-1188模擬物與靶基因Bcl-2和Sp1的干擾片段,確定mi R-1188是通過(guò)調(diào)控Bcl-2和Sp1的表達(dá)參與Hepa1-6細(xì)胞的生物學(xué)行為;并且體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)充分說(shuō)明了mi R-1188具有腫瘤抑制子的功能,并揭示了mi R-1188參與調(diào)控肝癌細(xì)胞行為的各種途徑。綜上所述,mi R-1188是一個(gè)廣泛表達(dá)于胚胎及各種癌癥細(xì)胞系的mi RNA。mi R-1188引起胚胎發(fā)育重量的減少和胎盤重量的增加,以及體內(nèi)外抑制肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)等生物學(xué)效應(yīng),并通過(guò)調(diào)控不同靶基因的表達(dá)參與生物體的各項(xiàng)活動(dòng)。深入研究mi R-1188的功能對(duì)進(jìn)一步研究小鼠Dlk1-Dio3區(qū)域內(nèi)mi RNAs的調(diào)控機(jī)制具有重要意義。
【學(xué)位授予單位】：哈爾濱工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R735.7;Q78

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